土壤中的微生物資源非常豐富，原核生物細(xì)胞含量大約1×10^7個／g，但用傳統(tǒng)技術(shù)培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的0.01％~10％，且大部分微生物處于不可培養(yǎng)的狀態(tài)，使相當(dāng)多的菌種不能被充分地開發(fā)和利用。由于土壤微生物成分復(fù)雜，常規(guī)提取總DNA的方法難以去除腐殖酸，而微量的腐殖酸便可抑制PCR擴增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶活性。另外，土壤質(zhì)地和成分的差異也會影響土壤微生物DNA的提取效果．
國內(nèi)外學(xué)者對不同的土壤DNA提取和純化方法進(jìn)行了比較研究，現(xiàn)行土壤微生物基因組DNA提取方法可分為直接法和間接法2類，直接法采用原位裂解土壤微生物提取DNA(一般采用直接法），間接法采用速差離心回收菌體，裂解菌體提取DNA．間接法會大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對DNA提取帶來的影響，但是這種方法會丟失許多微生物，得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組（宏基因組），目前已經(jīng)很少研究者會采用這種方法，所以以下將圍繞直接法進(jìn)行展開。
SDS的高鹽提取法：
取lg上壤，枷入2·7mLDNA提取液，2卑L蛋白酶K225r/min、37振蕩30min，加入0.3mL20%SDS，65度水?。扛?5～20min輕輕顛倒幾下），離心取沉淀加入0.9mLDNA提取液和0.1mL20%SDS,渦旋10s，65度水浴10min，離心收集上清，重復(fù)上述操作兩次，合并上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL無菌水溶解，
Eichner調(diào)整法:
取lg上壤，加入lmLPBS、0.5mL溶菌酶、20μL蛋白酶K。37度水浴2h，加溶液Ⅰ（5mol/LNaCl,10%CTAB) 100μL，65度水浴10min，離心去沉淀，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL用100μL無菌水溶解。
Kuske修訂法：
取1g上壤，加入2mL TENS混合，70度水浴1h，每隔15~20min輕輕顛倒幾下，離心留上清，沉淀用1.5mL TEN洗一次，離心取沉淀加1.5mL TEN,混勻，混勻，反復(fù)凍融3次，離心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用無菌水溶解．
Edgcomb改進(jìn)法：
取lg上壤，加入2mL PBS，225r／min、37度振蕩30min,離心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ（0.15mol/LNaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL 溶菌酶，37度水浴1.5h，加入5mol/L NaCI 270μL、溶于0.7mol/LNaCl的5mol/LCTAB270μL，水浴后加入2mL溶液Ⅱ（0.1mol/L NaCl,0.5mol/L Tris，10%SDS), 65度水浴10min，反復(fù)凍融3次，離心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL無菌水溶解．
Tsai報道的方法：
取lg上加入2mL PBS，225r/min，37度振蕩3min，離心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ（0.15mol/L NaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL溶菌酶，37度水浴2h后加入2mL正溶液II（0.15mol/L NaCl,0.5mol/L EDTA，10%SDS)反復(fù)凍融3次,離心取上清,酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用無菌水溶解．
高壓滅菌法：
取lg土壤，加lmL TE(l(10mM Tris.lmM EDTA、pH8.0），密封于滅菌的離心管中，離心管放入高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌條件為：121度、1min，然后快速放氣降壓，離心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL無菌水溶解．
綜上，通過實際操作發(fā)現(xiàn)，以上幾種土壤DNA提取方法普遍存在DNA得率低，或者DNA得率難于控制等問題。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個小范圍的土壤樣品DNA含量往往會差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學(xué)成分，如重金屬鹽，粘土物質(zhì)都會造成DNA得率降低。
鑒于以上問題，MP BIO公司開發(fā)出Fast DNA™ Spin Kit for Soil試劑盒，為目前土壤DNA快速高效提取提供了一種新選擇。
FastDNA Spin Kit for Soil可以在30分鐘內(nèi)快速有效地從土壤等環(huán)境樣本中直接提取基因組DNA。配合 MP FastPrep儀器使用，可在40秒內(nèi)破碎動植物組織，細(xì)菌，藻類，真菌孢子以及土壤等環(huán)境樣本中的其它組成。將樣品放入含有裂解介質(zhì)E的2ml管中，裂解介質(zhì)E含有陶瓷和二氧化硅顆粒，可有效破碎土壤等環(huán)境樣本中的有機物，如：真菌孢子和內(nèi)生孢子，革蘭氏陽性菌，酵母菌，藻類，線蟲和真菌。使用 FastPrep儀器，配合裂解介質(zhì)E及MT緩沖液和磷酸鈉緩沖液進(jìn)行研磨破碎，破碎之后這兩個緩沖液可以保護(hù)和溶解核酸及蛋白質(zhì)，并且最大*程度的降低基因組DNA被RNA污染。
產(chǎn)品特點：
●適用于不同類型的土壤
●無需有害試劑
●DNA產(chǎn)量高
●有效去除腐殖酸等PCR抑制劑
Fast DNA™ Spin Kit for Soil 可以在 30 分鐘內(nèi)快速有效地從土壤等環(huán)境樣本中直接提 取基因組 DNA。配合 MP FastPrep 儀器使用，可在 40 秒內(nèi)破碎動植物組織，細(xì)菌，藻類， 真菌孢子，以及土壤等環(huán)境樣本中的其它組成。
Fast土壤DNA快速提取操作步驟：
1. 在裂解介質(zhì)管 E 中最多加入 500mg 土壤樣品；
（注意：推薦最多加入 500mg 土壤樣品，含水量比較多的土壤或者碎屑多的土壤可適量減少樣品量。）
2. 在裂解介質(zhì)管 E 中加入 978μl Sodium Phosphate Buffer；
3. 加入 122μl MT Buffer；
（注意：為了得到更好的樣品處理效果，加入土壤樣品及兩個緩沖液后，在裂解介質(zhì)管中 仍能保留有 250-500μl 空間。）發(fā)生的反應(yīng)：用洗滌劑溶解細(xì)胞膜蛋白以及細(xì)胞外蛋白和土壤中的污染物。
4. 將樣品置于 FastPrep® 儀器上勻漿 40s，速度為 6.0m/s；發(fā)生的反應(yīng)：機械破碎土壤微生物的細(xì)胞壁，將核酸釋放入保護(hù)緩沖液中。
5. 14,000 x g 離心 5-10min 至沉渣；
注意：如果把離心時間延長到 15min，可以更好地使樣品量較大的，或者細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較 復(fù)雜的細(xì)胞碎片沉降到管底 。
6. 將上清液轉(zhuǎn)移至一個干凈的 2.0ml 離心管中。加入 250μL 的 PPS 溶液（蛋白質(zhì)沉淀溶 液），用手顛倒 10 次，使之充分混合；發(fā)生的反應(yīng)：將溶解的核酸與細(xì)胞沉渣以及裂解介質(zhì)分離。產(chǎn)生絮狀蛋白。
7. 14,000 x g 離心 5min 至沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移至一個干凈的 15ml 管中。注意：此步也可使用 2.0ml 離心管，但使用大管可以更好的混勻以及 DNA 的結(jié)合；發(fā)生的反應(yīng)：去除絮狀蛋白。
8. 重懸 Binding Matrix 溶液，將 1.0 ml 重懸液加入該 15ml 管中；
9. 用搖床或手動顛倒混勻 2min，使 DNA 更好的與 Binding Matrix 結(jié)合。之后將管子置于 管架上，靜置 3min，使 Binding Matrix 自然沉降；發(fā)生的反應(yīng)：在離液鹽存在的情況下，核酸與 Binding Matrix 結(jié)合。
10. 小心地去除 500μl 上清液，避免吸到沉淀下來的 Binding Matrix；
11. 用剩余的上清液輕輕的重懸 binding matrix，轉(zhuǎn)移大約 600μl 的重懸液至 SPIN™ Filter 中，14,000 x g 離心 1min，棄去收集管中的廢液。將 15ml 管中剩余的重懸液轉(zhuǎn)移到 SPIN™ Filter 中，再次離心棄去廢液；
12. 加入 500μl 預(yù)先準(zhǔn)備好的 SEWS-M 溶液，用槍頭輕輕吹打，小心地重懸沉淀；
注意：使用前確保 SEWS-M 溶液中已加入乙醇。在 SEWS-M 溶液中加入 100ml 100% 的乙醇，混勻。在瓶子上做好標(biāo)記，密閉儲存于室溫。發(fā)生的反應(yīng)：繼續(xù)溶解蛋白。
13. 14,000 x g 離心 1min，棄去廢液；發(fā)生的反應(yīng)：通過離心過濾，用脫鹽的乙醇和去垢劑去除雜質(zhì)，而 DNA 仍然與 Binding Matrix 結(jié)合。
14. 不加任何溶液，將 SPIN™ Filter 14,000 x g 離心 2min，去除殘留的 SEWS-M 溶液。棄去收集管，更換一個新的、干凈的離心管；
15. 將 SPIN™ Filter 置于室溫，晾干 5min；發(fā)生的反應(yīng)：去除殘留的乙醇。
16. 在 SPIN™ Filter 中加入 50-100μl 的 DES 溶液（或者無菌/無 DNA 酶的水），輕輕的 重懸 Binding Matrix。注意：a：為了避免過度稀釋純化出的 DNA，請盡量減少 DES 溶液的量 b：55?C 水浴孵育 5min 能提高純化產(chǎn)物的得率 ；發(fā)生的反應(yīng)：低鹽洗脫液使 Binding Matrix 和 DNA 再水合化，導(dǎo)致鹽橋斷裂，從而使 純化的核酸從 binding matrix 中洗脫下來。
17. 14,000 x g 離心 1min，使洗脫的 DNA 轉(zhuǎn)移至收集管中。棄去 SPIN™ Filter。得到的 DNA 純化產(chǎn)物可直接用于 PCR 及其它下游實驗。使用前可儲存于 4℃，長期保存可置 于-20℃；發(fā)生的反應(yīng)：最后純化的 DNA 可通過過濾柱，收集至一個新的離心管中。