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一、研究背景

乙型流感病毒（Flu B）是一種極具傳染性的呼吸道病原體，每年會(huì)引發(fā)大量感染和死亡病例，尤其在冬季高發(fā)，還可能導(dǎo)致腦炎、細(xì)菌性肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前，雖有疫苗和抗病毒藥物，但 Flu B 的抗原變異使其效果受限，因此急需快速準(zhǔn)確的診斷方法。

傳統(tǒng)的 Flu B 診斷方法，如病毒分離、抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速診斷的需求。近年來(lái)，基于 PCR 的分子診斷方法廣泛應(yīng)用，但存在依賴昂貴設(shè)備、需要專業(yè)技術(shù)人員操作以及反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，像環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA），能在恒溫下進(jìn)行，無(wú)需特殊熱循環(huán)設(shè)備和大量消耗試劑，不過(guò)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)影響其特異性.

二、材料與方法

RPA 引物設(shè)計(jì)與篩選：從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載 Flu B 核酸序列，根據(jù)特定保守區(qū)域設(shè)計(jì) 3 條正向（F1 - F3）和 3 條反向（R1 - R3）RPA 引物，由生工生物合成。用購(gòu)買(mǎi)的 Flu B 假病毒產(chǎn)品提取的 RNA 作模板，將引物兩兩組合，用商業(yè)試劑盒進(jìn)行 RPA 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 38°C 孵育 30 分鐘，1000 copies / 測(cè)試 RNA 模板。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量，篩選最佳引物組合。

crRNA 設(shè)計(jì)與篩選：根據(jù)選定引物序列，設(shè)計(jì) 6 條 Cas12a crRNA（crRNA1 - crRNA6），由商業(yè)試劑盒合成。在一鍋法 Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)中評(píng)估篩選，選擇檢測(cè)效率最高的 crRNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

一鍋法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)條件優(yōu)化：一鍋法 Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)包括 RT - RPA 擴(kuò)增和 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)兩部分。RT - RPA 反應(yīng)總體積 24μL，含特定濃度引物、RNA 模板、激活劑和無(wú)核酸酶水，在 38°C 反應(yīng) 30 分鐘。CRISPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)總體積 10μL，含特定緩沖液、Lb5Cas12a、crRNA 和單鏈 DNA（ssDNA）報(bào)告探針，在不同溫度下孵育 10 分鐘，設(shè)置不同工作溫度、Cas12a 濃度、crRNA6 濃度和 ssDNA 探針類型進(jìn)行優(yōu)化，收集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。

一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)條件優(yōu)化：一步法 Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)總體積 25μL，包含多種試劑。設(shè)置不同工作溫度、Cas12a 濃度、crRNA6 濃度和 ssDNA 探針類型，在不同溫度下反應(yīng) 45 分鐘，每分鐘收集熒光信號(hào)進(jìn)行優(yōu)化。 

敏感性分析：構(gòu)建含 Flu B 片段的重組質(zhì)粒，稀釋為不同濃度（200 copies / 測(cè)試、100 copies / 測(cè)試、50 copies / 測(cè)試、25 copies / 測(cè)試），每個(gè)濃度進(jìn)行 10 次重復(fù)反應(yīng)。用 Sigmoid 函數(shù)根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果預(yù)測(cè)一步法檢測(cè)的最低檢測(cè)限（LOD）。

特異性檢測(cè)：收集 6 種干擾樣本（A 群鏈球菌（GAS）、鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）、人副流感病毒（HPIV）、肺炎支原體（MP）、肺炎克雷伯菌（KP）和 H1N1 禽流感病毒（H1N）），以 Flu B 假病毒核酸為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照，用一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù) 3 次。

臨床樣本驗(yàn)證：淮北人民醫(yī)院提供 101 份咽拭子樣本，用商業(yè)試劑盒提取 RNA 作模板進(jìn)行 RT - RPA 反應(yīng)。同時(shí)用一鍋法和一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 方法檢測(cè)樣本，以 PCR 方法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析兩種方法與 PCR 方法的一致性。 

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析：檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)熒光倍數(shù)表示，每個(gè)樣本至少檢測(cè) 3 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。用 GraphPad Prism 10 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò) Student’s t 檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用 Sigmoid 函數(shù)預(yù)測(cè) LOD，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 

三、研究結(jié)果

檢測(cè)系統(tǒng)工作流程：一鍋法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)中，RT - RPA 反應(yīng)在管底進(jìn)行，CRISPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)在管蓋準(zhǔn)備。Flu B 靶序列經(jīng) RT - RPA 擴(kuò)增后，通過(guò)短時(shí)間離心將 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)混入 RT - RPA 反應(yīng)體系，借助 FAM 標(biāo)記的 ssDNA 探針釋放熒光信號(hào)，40 分鐘內(nèi)可完成檢測(cè)。一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)將兩種檢測(cè)試劑整合在一個(gè)反應(yīng)中，45 分鐘內(nèi)完成反應(yīng)并在熒光信號(hào)檢測(cè)儀上分析。

引物和 crRNA 篩選結(jié)果：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估 9 種引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物，確定 F1/R2 為最佳引物組合。在一鍋法檢測(cè)系統(tǒng)中篩選 6 條 crRNA，發(fā)現(xiàn) crRNA6 檢測(cè)效率最高，因此選擇 crRNA6 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

系統(tǒng)條件優(yōu)化結(jié)果：一鍋法系統(tǒng)中，確定 Cas12a 最佳工作溫度為 42°C，最佳濃度為 250nM，P8C 的 ssDNA FAM 標(biāo)記探針性能最佳。一步法系統(tǒng)中，最佳反應(yīng)溫度為 40°C，Cas12a 最佳濃度為 125nM。

敏感性和特異性檢測(cè)結(jié)果：一鍋法和一步法檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同濃度重組質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果顯示，兩者檢測(cè)率相同，一步法檢測(cè)系統(tǒng)的 LOD 為 58 copies / 測(cè)試。特異性檢測(cè)中，只有陽(yáng)性對(duì)照樣本產(chǎn)生明顯熒光信號(hào)，干擾樣本無(wú)明顯信號(hào)，表明一步法檢測(cè)系統(tǒng)對(duì) Flu B 檢測(cè)特異性高，無(wú)交叉反應(yīng)。

臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果：101 份臨床咽拭子樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，一鍋法檢測(cè)系統(tǒng)敏感性為 81.25%，特異性為 98.82%，與 PCR 方法一致性為 96.03%；一步法檢測(cè)系統(tǒng)敏感性為 56.25%，特異性為 100%，與 PCR 方法一致性為 93.06%。

四、討論

本研究開(kāi)發(fā)的一步法 Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)，整合 RT - RPA 和 CRISPR/Cas12a 技術(shù)，能在 45 分鐘內(nèi)特異性識(shí)別 Flu B，LOD 為 58 copies / 測(cè)試。與 PCR 方法相比，該系統(tǒng)特異性高（100%），總體一致性達(dá) 93.06%，有助于 Flu B 的早期診斷和精準(zhǔn)治療。

目前基于 RT - RPA 的平臺(tái)雖能在 1 小時(shí)內(nèi)篩查流感病毒和新冠病毒，敏感性可達(dá) 10 copies 病毒 RNA，但非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的假陽(yáng)性限制了其應(yīng)用?；?RPA - CRISPR/Cas12a 的 Flu B 檢測(cè)方法敏感性雖高，但多為兩步法，需開(kāi)蓋操作，增加氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，操作復(fù)雜，不利于臨床應(yīng)用。本研究的一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)在單管內(nèi)完成所有反應(yīng)，無(wú)需開(kāi)蓋，避免氣溶膠污染，成本降低 75%，主要通過(guò)減少反應(yīng)體積和降低 Cas12a 濃度實(shí)現(xiàn)，同時(shí)抑制了 Cas12a 的順式切割活性。

與 PCR 相比，PCR 的高 Ct 值會(huì)導(dǎo)致 “灰色地帶” 問(wèn)題，而本研究的一鍋法和一步法檢測(cè)系統(tǒng)在臨床樣本中特異性和一致性高，有效避免該問(wèn)題。不過(guò)，一步法檢測(cè)系統(tǒng)在臨床樣本中的敏感性（56.25%）低于一鍋法（81.25%），可能與單一反應(yīng)條件和臨床樣本中病毒載量低有關(guān)，且本研究臨床樣本數(shù)量有限，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。

此外，Cas12a 的順式切割活性影響一步法反應(yīng)的敏感性，本研究通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)溫度和 Cas12a 濃度降低其影響。同時(shí)，其他技術(shù)如光控 crRNA 激活系統(tǒng)和基于水凝膠的檢測(cè)平臺(tái)等不斷發(fā)展，有望進(jìn)一步提高一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)檢測(cè) Flu B 及其他 RNA 病毒的性能。

綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)的一鍋、一步法 Flu B 檢測(cè)系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、無(wú)污染，所有試劑可凍干預(yù)制備，為 Flu B 的即時(shí)診斷奠定基礎(chǔ)，也為一步法 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在其他病原體分子診斷中的應(yīng)用提供參考。

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