副溶血性弧菌廣泛存在于海產(chǎn)品、海洋及河口生態(tài)系統(tǒng)中，能夠引發(fā)鰓腐病、蝦紅體病、早死綜合征以及急性肝胰腺壞死病等多種水生物種疾病，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用氟苯尼考以及部分磺胺類和喹諾酮類抗生素。由于缺乏嚴(yán)格的監(jiān)控與管理，抗生素濫用加劇了海水養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血性弧菌的抗菌素耐藥性問題。近年來，等溫核酸擴增方法在食源性致病菌和耐藥基因（ARGs）檢測中的應(yīng)用明顯增加。重組酶聚合酶等溫擴增（RPA）技術(shù)能在溫和的溫度條件下，在5-20分鐘內(nèi)將目標(biāo)核酸擴增至可檢測水平。然而，氣溶膠交叉污染風(fēng)險阻礙了RPA在現(xiàn)場開放環(huán)境的應(yīng)用。
具有高通量和自動化操作能力的微流控技術(shù)，能夠整合樣品處理、核酸擴增和檢測過程至單一芯片中。其中，離心式微流控芯片利用離心力通過微通道將樣品及反應(yīng)體系均勻分布于檢測微孔內(nèi)，最大程度的降低交叉污染的風(fēng)險，在食源性細(xì)菌及ARGs現(xiàn)場檢測方面展現(xiàn)出巨大潛力。近日，中國計量大學(xué)蔣晗副教授和呂晨澤副教授研究團(tuán)隊開發(fā)了一種快速、準(zhǔn)確的免疫磁分離（IMS）-RPA-微流控檢測技術(shù)，集成樣品濃縮、核酸提取及等溫擴增步驟，實現(xiàn)副溶血性弧菌及相關(guān)ARGs的實時監(jiān)測，相關(guān)研究成果以“Simultaneous detection of Vibrio parahemolyticus and antimicrobial resistance genes using immonomagnetic separation combined with RPA-microfluidic method in seafood”為題發(fā)表于高水平期刊Food Control。該研究利用優(yōu)化后的IMS技術(shù)完成樣品的預(yù)處理和靶向富集，采用創(chuàng)新設(shè)計的離心微流控芯片檢測副溶血性弧菌及其floR、sul1和qnrA基因。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該技術(shù)對實驗條件和操作人員的要求明顯降低，為現(xiàn)場快速監(jiān)測食源性微生物及其ARGs的挑戰(zhàn)提供可行的解決方案。
圖1 免疫磁分離（IMS）技術(shù)聯(lián)合RPA-微流控法同時檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌及其耐藥基因的操作流程及原理示意圖。
該研究使用的微流控芯片為直徑80毫米、厚度2.5毫米的緊湊圓盤結(jié)構(gòu)，包含8個獨立單元，每個單元均設(shè)有1個樣品孔、1個排氣口和4個微反應(yīng)室。每個微反應(yīng)室內(nèi)預(yù)先裝載擴增體系混合物。位于微反應(yīng)室前的球閥負(fù)責(zé)確保反應(yīng)混合物能夠順利轉(zhuǎn)移并填充反應(yīng)室完成核酸擴增及檢測。在檢測時，通過微流控芯片的樣品孔注入樣品液，隨后使用密封膜對樣品孔進(jìn)行封閉。然后，將組裝好的微流控芯片置入檢測裝置中。樣本液通過離心力均勻分布于各個反應(yīng)室內(nèi)，在設(shè)定溫度下進(jìn)行實時熒光RPA反應(yīng)。檢測裝置收集和處理每個反應(yīng)室的熒光信號，最終獲得樣品液的實時擴增曲線。
圖2 副溶血性弧菌高度保守的物種特異性基因toxR和3個耐藥基因floR、sul1和qnrA的RPA-微流控芯片檢測平臺原理圖。
免疫磁珠（IMB）的數(shù)量顯著影響IMS方法的靈敏度，為獲得最佳的捕獲效率（CE），研究人員實驗了多種濃度的IMB，根據(jù)結(jié)果確定0.4 mg為副溶血性弧菌最佳使用量。同時測試獲得最佳孵育時間和孵育溫度。當(dāng)副溶血性弧菌在10? CFU/mL時，CE約為91.87% ± 1.8%，非目標(biāo)細(xì)菌的CE保持在15%以下，因此優(yōu)化后的IMS技術(shù)對副溶血性弧菌具有明顯的特異性。
圖3 優(yōu)化IMS技術(shù)的（A）免疫磁珠（IMB）用量、（B）孵育時間、（C）分離時間、（D）副溶血性弧菌濃度、（E）特異性。
研究團(tuán)隊采用常規(guī)培養(yǎng)法、qPCR法和該研究開發(fā)的IMS-RPA微流控法三種方法對180份實際樣本進(jìn)行分析檢測分析。結(jié)果顯示，共有112個樣本被確定為副溶血性弧菌陽性，三種方法獲得結(jié)果一致性達(dá)到100%。采用IMS-RPA-微流控技術(shù)和qPCR檢測112株副溶血性弧菌中floR、sul1和qnrA 這3種ARGs的存在情況。檢測結(jié)果證實IMS-RPA微流控方法具有優(yōu)異的特異性、靈敏度和檢測精度，該技術(shù)高效、可靠，能夠同時檢測海產(chǎn)品樣品中的副溶血性弧菌和多種ARGs。
圖4 （A-G）RPA-微流控法同時檢測海產(chǎn)品樣品中副溶血性弧菌及其耐藥基因floR、sul1和qnrA；（H）芯片上各功能單元的詳細(xì)視圖。
論文信息：
https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2024.110653
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