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膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）首次應(yīng)用是用Ⅱ型膠原免疫Wistar(遠(yuǎn)親雜交)、Sprague-Dawley(遠(yuǎn)親雜交)和Wistar-Lewis (近交) 中誘導(dǎo)成功。由于此CIA模型具有與人風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎（RA）相同的免疫和病理特征，因此該模型先后擴(kuò)展到小鼠及非人靈長類動(dòng)物，并已作為人類關(guān)節(jié)炎研究的廣泛應(yīng)用的模型。然而，對于CIA模型來說，不同種屬動(dòng)物之間是有差異的。小鼠對CIA的敏感性與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）相關(guān)，在小鼠品系中只有DBA/1(H-2q)和B10.RⅢ(H-2r)兩個(gè)品系對CIA敏感。大鼠對CIA的敏感性也與MHC相關(guān)，并與小鼠相比具有較寬的品系范圍。因此，不同MHC型的不同品系的大鼠，盡管關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率、嚴(yán)重程度及抗體和T-cell 的特異性在不同品系間不同，但都能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。
動(dòng)物的管理與飼養(yǎng)
動(dòng)物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物。一般來說，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應(yīng)答。無菌的大鼠對佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎高度易感（AIA），其次是SPF級大鼠及一般大鼠敏感性相對較低。即使同一品系,CIA 的發(fā)病率及嚴(yán) 重程度也有顯著差異，這種差異是由于飼養(yǎng)條件造成的。
眾所周知，小鼠的飲食影響 CIA的發(fā)病率及嚴(yán)重程度。然而在大鼠在中沒有進(jìn)行廣泛研究。與小鼠相比，大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答更快且較短時(shí)間內(nèi)能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，因此飲食對小鼠來可能不是影響關(guān)節(jié)炎的重要因素。然而，像小鼠一樣，飼以高脂肪的食物對誘發(fā)關(guān)節(jié)炎更有利。
大鼠的品系
對Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答以及關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展與MHCRT1位點(diǎn)相關(guān)而且用于免疫的Ⅱ型膠原的動(dòng)物來源不同也會(huì)造成大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答以及關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展上的差異。然而，與小鼠相比，很多品系的大鼠對CIA敏感，并能誘發(fā)一定程度的關(guān)節(jié)炎。一般來說，豬的Ⅱ型膠原是最好的致炎膠原其后是牛的二型膠原，雞的二型膠原致炎性最差。以下大鼠品系是已明確的對CIA高度易感的品系：BB/DR (RT1u),Wistar Furth, LOU (RT1u), OM (RT1u)和 LEW (RT11) 大鼠。
動(dòng)物質(zhì)量也很重要。在這方面，腸道菌群可能是影響機(jī)體對二型膠原免疫應(yīng)答和關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要影響因素之一。例如:Lewis 大鼠對CIA高度易感，同時(shí)發(fā)病率和炎癥嚴(yán)重程度都很高。但是同是SPF級Lewis 大鼠對CIA的敏感性由于年齡、飼養(yǎng)條件及免疫腸道菌而對CIA的敏感性存在顯著差異。MDP(胞壁酰二肽)對加強(qiáng)Lewis 大鼠對CIA的發(fā)病率和嚴(yán)重程度非常有效。但是我們建議在用Lesis 大鼠造模之前先進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)，據(jù)我們所知BB大鼠是用于CIA造模最好的品系。 DA大鼠對CIA的敏感，但是同時(shí)AIA（佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎）及礦物油誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（僅礦物油）高度敏感，因此不推薦用于CIA的造模。
備注：
1.與小鼠相反大鼠對同源（大鼠）Ⅱ型膠原是敏感的，同時(shí)誘發(fā)和猴一樣的關(guān)節(jié)炎。
2. 與小鼠和猴子相反，大鼠對Ⅱ型膠原抗體是針對Ⅱ型膠原分子構(gòu)象的特異性抗體。因此膠原變性或免疫Ⅱ型膠原的單獨(dú)CB肽段都不能在大鼠中致炎。
膠原
因?yàn)槿ヌ腔哪z原會(huì)影響關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，同時(shí)一些未去除的雜質(zhì)比如：胃蛋白酶可能會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞刺激試驗(yàn)中產(chǎn)生假陽性，因此Ⅱ型膠原應(yīng)按規(guī)定高度純化。如果按恰當(dāng)?shù)姆椒▋龈傻哪z原-20℃避光保存的條件下，是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。（見表1）
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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20011 |
雞Ⅱ型膠原（凍干） |
10mg |
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20012 |
雞2型膠原（液體） |
5 ml x 2 mg/ml |
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20021 |
牛2型膠原（凍干） |
10 mg |
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20022 |
牛2型膠原（液體） |
5 ml x 2 mg/ml |
乳劑的制備
1）由于大鼠通常對佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（AIA）是敏感的，因此必須使用不完全佐劑（IFA）,貨號是7002。乳劑的質(zhì)量是能否誘發(fā)關(guān)節(jié)炎高發(fā)病率的關(guān)鍵因素。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導(dǎo)致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個(gè)片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動(dòng)的高速攪拌器：
用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，F(xiàn)ig.1）攪拌不完全佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架臺(tái)上，并冰浴。最后一步很重要，因在攪拌過程中會(huì)發(fā)熱，會(huì)引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）。
Fig1. 高速攪拌器Fig2 刀片，截?cái)嗟淖⑸淦?，漢密爾頓玻璃注射器
Fig. 截?cái)嗟淖⑸淦?，支架上固定，冰?/span>
2) 加1體積（最多2.5mL）不完全完全佐劑到注射器，再加等體積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。
3) 繼續(xù)混合，直到在最大轉(zhuǎn)速產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液（轉(zhuǎn)速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積（2-5Ml）為了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中移動(dòng)攪拌位置。
注：可能需重復(fù)攪拌2-3次
4) 將一滴乳劑滴與一燒杯水中，檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的，在水中是成團(tuán)的，不散開。
注：如果乳劑在水面散開，表明乳劑不穩(wěn)定。再加幾滴佐劑，重新混合后，再檢測。
5)將乳劑轉(zhuǎn)移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因?yàn)楹茈y做到一個(gè)準(zhǔn)確的注射劑量。
注1：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個(gè)精確的注射劑量。
注2：建議在乳劑制備好的一小時(shí)內(nèi)，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。
注射部位
在鼠尾根部注射0.2mL(膠原：200μg)乳劑（Fig.4）。例如：從尾根部50px處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強(qiáng)免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下?lián)笪哺?.5cm處。
注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1ml）。
注2：無論如何，我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強(qiáng)免疫。因?yàn)椴煌耆魟┰诟鼓ず透骨灰饑?yán)重的炎癥反應(yīng)。
免疫程序
Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型（可激活補(bǔ)體），對關(guān)節(jié)炎發(fā)生很重要。依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠泻芏喾N方法可誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節(jié)炎。
a. 通過單次免疫（無加強(qiáng)免疫）誘發(fā)關(guān)節(jié)炎
依據(jù)說明書方法制備乳劑（膠原-不完全佐劑）和免疫，由于不同品系的的敏感性的差異，一般在2-3周可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。在一些免疫應(yīng)答較強(qiáng)的品系，發(fā)病率達(dá)到80-90%。對于一些高度易感品系如BB大鼠，關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，臨床評分可達(dá)到10-12分（最高16分）。
b 通過加強(qiáng)免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)
為了確保關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和嚴(yán)重度，可在初次免疫7天后加強(qiáng)免疫。按說明書方法，準(zhǔn)備膠原-不完全佐劑，尾部皮下注射0.1mL,會(huì)短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。
按要求制備膠原+IFA 乳劑（1：1）
初次免疫(0day) ：200 ul乳劑/只
加強(qiáng)免疫（7day）：100ul 乳劑/只
關(guān)節(jié)炎的發(fā)生
于小鼠相比（約4周），關(guān)節(jié)炎在大鼠中產(chǎn)生的更快，初次免疫后，2-3周出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹。在BB大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的時(shí)間比其它品系更快，約12-14天。如果免疫有效，3周后100%發(fā)生關(guān)節(jié)炎。
臨床評分
關(guān)節(jié)炎可通過臨床評分來定性評估或用測厚儀來測量爪子厚度來評估。這些方法適用于所有的關(guān)節(jié)炎模型比如經(jīng)典的CIA，佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和棉線誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。
表2 關(guān)節(jié)炎炎癥程度的臨床評分
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得分 |
發(fā)病情況 |
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0 |
正常 |
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1 |
輕度的、踝關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)發(fā)紅、腫脹 |
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2 |
踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)中度發(fā)紅腫脹 |
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3 |
爪子嚴(yán)重發(fā)紅、腫脹，包括指端 |
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4 |
四肢最大程度發(fā)炎，包括多關(guān)節(jié)。 |