磁珠分選- 方案A：MagniSort?陽(yáng)性分選

引言

     下述方案是MagniSort?陽(yáng)性分選試劑盒的通用操作指南。具體請(qǐng)參見(jiàn)試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)。在陽(yáng)性分選中，待分選的細(xì)胞首先與生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合，然后被鏈酶親合素包被的磁珠捕獲。將細(xì)胞放入MagniSort?磁座后，陽(yáng)性細(xì)胞被磁場(chǎng)吸住，而陰性細(xì)胞仍游離在溶液中，可被棄掉。每個(gè)試劑盒中的生物素化抗體和磁珠預(yù)先已滴定好最適濃度，為即用型試劑。

 

注意事項(xiàng)

注：MagniSort? 5mL磁座可產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)。應(yīng)遠(yuǎn)離心臟起搏器、信用卡、磁性身份卡、手表、計(jì)算機(jī)顯示器、硬盤(pán)等物品，以免損壞。

 

細(xì)胞制備

1. 在未特別說(shuō)明的情況下，MagniSort?陽(yáng)性分選試劑盒已優(yōu)化，適用于小鼠二級(jí)淋巴組織或正常人PBMC。

2. 用于小鼠細(xì)胞時(shí)，建議用40μm的尼龍細(xì)胞篩清除碎屑，以使試劑盒發(fā)揮出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制備，參見(jiàn)“細(xì)胞制備-方案D：從全血中提取PBMC”（第28頁(yè)）。為使MagniSort?試劑盒發(fā)揮最佳性能，建議徹底洗滌白膜層，去除血小板。

4. 向緩沖液中加入EDTA減少細(xì)胞聚集。

 

后續(xù)用于無(wú)菌培養(yǎng)

1. MagniSort?陽(yáng)性分選抗體和陽(yáng)性分選磁珠中含有少量疊氮化鈉作為防腐劑。當(dāng)使用不含疊氮化鈉的無(wú)菌緩沖液時(shí)，它不會(huì)影響細(xì)胞功能。需要根據(jù)測(cè)試判斷在特定實(shí)驗(yàn)中的性能。

2. 分選無(wú)菌細(xì)胞時(shí)應(yīng)該在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無(wú)菌試管和無(wú)菌緩沖液。

 

提供的材料

? MagniSort?陽(yáng)性分選抗體，200次試驗(yàn)，20μL/次試驗(yàn)。2-8°C貯存。

? MagniSort?陽(yáng)性分選磁珠，4mL。2-8°C貯存。

所需其他材料

? 細(xì)胞分選推薦使用的緩沖液：添加3%胎牛血清（FBS）和10mM EDTA的PBS或Hank平衡鹽溶液（HBSS）。2-8°C貯存。

? MagniSort?磁座，5mL。

? 12 x 75 mm流式管(5 mL，BD Falcon?，貨號(hào)352008或類(lèi)似產(chǎn)品)。

? 15mL離心管(BD Falcon?，貨號(hào)352099或類(lèi)似產(chǎn)品)

 

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分離液，制備濃度為1x107細(xì)胞/100μL（1 x 108/mL）的淋巴細(xì)胞懸液。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

2. 將所需數(shù)量的細(xì)胞（不能超過(guò)2 x 108個(gè)細(xì)胞）放入12 x 75 mm的5mL試管中。

3. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort?陽(yáng)性分選抗體。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

4. 加入細(xì)胞分離液洗滌細(xì)胞，使其總體積達(dá)到4mL，在300xg下離心5分鐘。

5. 棄上清，然后用細(xì)胞分離液完全重懸細(xì)胞至最初的體積。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

6. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort?陽(yáng)性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

注：為確保最佳性能，將MagniSort?陽(yáng)性分選磁珠加入細(xì)胞之前必須充分混勻。將設(shè)定為1mL的Pipetman? P1000移液器上下吹打5次，或者采用渦旋的方式完全重懸磁珠。7. 用細(xì)胞分離液將體積加至2.5mL。將設(shè)定為1mL的Pipetman?P1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。

8. 將試管完全插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。

9. 拿起磁座將試管內(nèi)的上清液倒入廢液容器內(nèi)；這些是不需要（未結(jié)合）的細(xì)胞。將試管倒置1秒鐘，然后回正。注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會(huì)降低回收率。如果需要也可以收集起結(jié)合細(xì)胞。

10. 從磁座中取出試管并重復(fù)7-9步兩次，總共洗滌細(xì)胞3次。

11. 從磁座中取出含目標(biāo)細(xì)胞的試管，加入1mL細(xì)胞分離液。沿著試管側(cè)壁加入緩沖液，洗滌試管側(cè)壁。此時(shí)，試管內(nèi)就是分選的陽(yáng)性細(xì)胞，備用。

 

磁珠分選 -方案B：MagniSort?陰性分選

 

簡(jiǎn)介

     以下是MagniSort?陰選試劑盒的通用操作指南，該試劑盒適用于細(xì)胞進(jìn)行陰性分選。具體請(qǐng)參見(jiàn)每個(gè)試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)。在陰性分選中，不需要的細(xì)胞與生物素化抗體混合液結(jié)合，然后加入鏈霉親和素包被的磁珠。將細(xì)胞放入MagniSort?磁座后，不需要的細(xì)胞被磁場(chǎng)吸住，而需要的細(xì)胞游離在溶液中，將其倒出后即可使用。每個(gè)試劑盒中的生物素化抗體和磁珠已預(yù)先滴定好最適濃度，為即用型試劑。

 

注意事項(xiàng)

注意：MagniSort? 5mL磁座可產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)。應(yīng)遠(yuǎn)離心臟起搏器、信用卡、磁性身份卡、手表、計(jì)算機(jī)顯示器、硬盤(pán)等物品，以免損壞。

 

細(xì)胞制備

1. 在未特別指明的情況下，MagniSort? 陰選試劑盒已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，專(zhuān)門(mén)適用于小鼠二級(jí)淋巴組織或正常人PBMC。

2. 用于小鼠細(xì)胞時(shí)，建議用40μm的尼龍細(xì)胞篩清除碎屑，以使試劑盒發(fā)揮出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制備，參見(jiàn)“細(xì)胞制備-方案D：從全血中提取PBMC”（第28頁(yè)）。為使MagniSort?試劑盒發(fā)揮最佳性能，建議徹底洗滌白膜層，去除血小板。

4. 緩沖液中加入EDTA減少細(xì)胞聚集。

 

后續(xù)用于無(wú)菌培養(yǎng)

1. MagniSort?陰選抗體混合液和陰性分選磁珠中含有少量疊氮化鈉作為防腐劑。當(dāng)使用不含疊氮化鈉的無(wú)菌緩沖液時(shí)，它不會(huì)影響細(xì)胞功能。需要根據(jù)測(cè)試判斷在特定實(shí)驗(yàn)中的性能。

2. 分選無(wú)菌細(xì)胞時(shí)應(yīng)該在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無(wú)菌試管和無(wú)菌緩沖液。

 

提供的材料

? MagniSort?陰選抗體混合液，200次實(shí)驗(yàn)，20μL/次試驗(yàn)。2-8°C貯存。

? MagniSort?陰性分選磁珠，4mL。2-8°C貯存。

所需其他材料

? 細(xì)胞分選推薦使用的緩沖液：PBS或添加3%FBS和10mM EDTA的HBSS。2-8°C貯存。

? MagniSort?磁座，5mL

? 12 x 75 mm流式管(5 mL, BD Falcon?, 貨號(hào)352008或類(lèi)似產(chǎn)品)

 

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分離液，制備濃度為1x107細(xì)胞/100μL（1 x 108/mL）的單細(xì)胞懸液。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

2. 將所需數(shù)量的細(xì)胞（不能超過(guò)2 x 108個(gè)細(xì)胞）放入12 x 75 mm的5mL試管中。

3. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort?陰選抗體混合液。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

4. 用細(xì)胞分離液洗滌細(xì)胞，使其總體積達(dá)到4mL，300xg離心5分鐘。

5. 棄上清，然后用細(xì)胞分離液完全重懸細(xì)胞至最初的體積。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

6. 向每100μL細(xì)胞中加入20μL MagniSort?陰性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育5分鐘。

注：為確保最佳性能，將MagniSort?陰性分選磁珠加入細(xì)胞之前必須充分混勻。將設(shè)定為1mL的Pipetman? P1000移液器上下吹打5次，完全重懸磁珠，不能渦旋。

7. 用細(xì)胞分離液將體積加至2.5mL。將設(shè)定為1mL的Pipetman?P1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。

8. 將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。

9. 拿起磁座以連續(xù)的動(dòng)作將試管內(nèi)的上清液倒入一支新的12x75 mm 5mL試管中并將磁座內(nèi)的試管倒置1秒鐘，然后回正。

注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會(huì)降低未結(jié)合細(xì)胞的純度。

10. 將磁座中的試管丟棄。

11. 此時(shí)，新5mL 12 x 75 mm試管中的陰性細(xì)胞即為分選后的目的細(xì)胞，備用。

 

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