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PA-Taq新型親和標(biāo)簽系統(tǒng)（日本wako）是利用單克隆抗體（NZ-1）識(shí)別肽標(biāo)簽（GVAMPGAEDDVV）的高親和性&高特異性的親和純化標(biāo)簽系統(tǒng)。PA tag 系統(tǒng)的親和性特異性優(yōu)于現(xiàn)有標(biāo)簽系統(tǒng)，抗體微珠可再生40-60次，可用于免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)，是動(dòng)物宿主細(xì)胞重組蛋白生產(chǎn)中的有效工具。
◆特點(diǎn)
● 通過(guò)樹(shù)脂再生，降低運(yùn)行成本
● 超高親和性抗體，實(shí)現(xiàn)高回收率、高純度純化
● 在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系（HEK293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞等）中，有效純化蛋白
● PA標(biāo)簽系統(tǒng)是使用可識(shí)別肽標(biāo)簽（12個(gè)氨基酸殘基）的單抗（NZ-1）。日本開(kāi)發(fā)的親和性純化標(biāo)簽系統(tǒng)。
● NZ-1單抗對(duì)PA tag具有高親和性和特異性，可應(yīng)用于Western Blotting、細(xì)胞流式分析、免疫組化（ICC）。
通過(guò)免疫沉淀，可純化PA標(biāo)簽融合蛋白以及樹(shù)脂再生。
● PA標(biāo)簽系統(tǒng)，可一步純化高純度PA標(biāo)簽融合蛋白。
◆PA標(biāo)簽系統(tǒng)
Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).
Fujii,
Y. et al.
新型親和標(biāo)簽系統(tǒng)“PA tag”的應(yīng)用方法~蛋白的純化及檢測(cè)~ 蛋白科學(xué)學(xué)會(huì)檔案, 7, e075 (2014)
◆PA標(biāo)簽表達(dá)載體案例
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載體 |
表達(dá)模式 |
宿主細(xì)胞 |
MCS啟動(dòng)子 |
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pCAG |
瞬時(shí)表達(dá) |
靈長(zhǎng)類（人、猴）、犬細(xì)胞等粘著細(xì)胞 |
CAG |
◆用PA標(biāo)簽從培養(yǎng)上清中親和提純的案例
數(shù)據(jù)提供：大阪大學(xué) 蛋白研究所附屬蛋白分析先進(jìn)研究中心
分子創(chuàng)制學(xué)研究室 高木淳一老師，藤井勇樹(shù)老師
◆Protocol目的蛋白的純化
１．哺乳類動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染(HEK293T)
轉(zhuǎn)染處于40-60%融合狀態(tài)的細(xì)胞
培養(yǎng)基：D-MEM, 5%FBS
２．回收培養(yǎng)上清和吸附蛋白樹(shù)脂
轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，回收約420 mL培養(yǎng)上清，加入8 mL抗PA標(biāo)簽抗體瓊脂糖珠，混合2小時(shí)（2-10℃）
３．樹(shù)脂回收
用50
mL的純化柱?；厥詹襟E2)中的瓊脂糖珠
４．樹(shù)脂洗滌
加入珠4倍量的TBS 緩沖液（20 mM
Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次
５．PA標(biāo)簽肽從樹(shù)脂中競(jìng)爭(zhēng)性洗脫
加入經(jīng)1×TBS溶液, pH 7.5溶解過(guò)的PA 標(biāo)簽肽（終濃度0.1 mg/mL），體積量需為珠的一倍，
然后分10次回收PA標(biāo)簽融合蛋白X
６．SDS-PAGE
樣品量
c.
sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脫（1-10）：各10 μL
可純化PA標(biāo)簽融合蛋白X且不依賴PA標(biāo)簽。→可實(shí)現(xiàn)極高純度的親和純化。
◆通過(guò)PA tag降低背景的方法
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M: Marker |
在20 mL的昆蟲(chóng)細(xì)胞溶解液中加入蛋白Z，使其濃度變?yōu)?span>1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA標(biāo)簽抗體瓊脂糖珠，4℃溫度條件下，攪拌3小時(shí)。
分別用不同濃度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）進(jìn)行調(diào)整，用瓊脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室溫條件下平穩(wěn)震動(dòng)5 min。
離心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和處理。
SDS-PAGE后進(jìn)行銀染，比較去除污染蛋白之后，不同濃度下的結(jié)果。
◆使用案例：Western Blotting
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地域革新領(lǐng)域 加藤 幸成老師，金子 美華老師 NZ-1顯示出與天然抗體具有相同的高檢測(cè)靈敏度。 |
Lane 1 一抗：抗IDH1抗體（RcMab-1）, 1 μg/mL
二抗：抗大鼠IgG-HRP標(biāo)簽, 1000倍稀釋 一抗：抗PA tag抗體, 1 μg/mL
二抗：抗大鼠IgG-HRP標(biāo)簽, 1000倍稀釋 一抗：抗DYKDDDDK標(biāo)簽抗體, 3.5 μg/mL
二次抗體：抗小鼠IgG-HRP標(biāo)簽, 1000倍稀釋 |
◆PA標(biāo)簽系列
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產(chǎn)品名稱 |
子類克隆號(hào) |
適用實(shí)驗(yàn) |
規(guī)格 |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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單抗 |
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抗PA標(biāo)簽, 大鼠單抗 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody |
大鼠IgG2a |
IP, WB, FCM, ICC |
免疫化學(xué)用 |
200 μL |
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1 mL |
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HRP標(biāo)簽單抗 |
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抗PA標(biāo)簽, 大鼠單抗,過(guò)氧化酶結(jié)合 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated |
大鼠IgG2a NZ-1 |
WB |
免疫化學(xué)用 |
200 μL |
|
|
1 mL |
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產(chǎn)品名稱 |
子類克隆號(hào) |
規(guī)格 |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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抗體結(jié)合瓊脂糖珠 |
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抗PA標(biāo)簽抗體瓊脂糖珠 Anti PA tag Antibody Beads |
大鼠IgG2a NZ-1 |
免疫化學(xué)用 |
2 mL(Net 1 mL) |
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10 mL (Net 5 mL) |
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50 mL (Net 25 mL) |
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識(shí)別N端、C端的PA標(biāo)簽 |
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抗體結(jié)合磁珠 |
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MagCaptureTM HP 抗PA標(biāo)簽抗體磁珠 MagCapture? HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads |
大鼠IgG2a NZ-1 |
免疫化學(xué)用 |
2 mL |
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溶液組成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide |
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產(chǎn)品名稱 |
備注 |
規(guī)格 |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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肽 |
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PA標(biāo)簽肽 PA tag Peptide |
含量（HPLC）95%以上 |
基因研究用 |
5 mg |
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25 mg |
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清洗溶液 |
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PA標(biāo)簽清洗溶液 PA tag Washing Solution |
已過(guò)濾消毒 |
基因研究用 |
50 mL |
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產(chǎn)品名稱 |
可選Marker |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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大腸桿菌 |
動(dòng)物細(xì)胞 |
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瞬時(shí)載體 |
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pCAG-Ble PA 標(biāo)簽-C pCAG-Ble PA tag-C |
Bleomycin |
20 μg |
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pCAG-Ble PA 標(biāo)簽-N 信號(hào) 增加型 pCAG-Ble PA tag-N Signal Plus |
Bleomycin |
20 μg |
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pCAG-Bsd PA 標(biāo)簽-C pCAG-Bsd PA tag-C |
Blasticidin S |
20 μg |
||
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pCAG-Bsd PA 標(biāo)簽-N 信號(hào) 增加型 pCAG-Bsd PA tag-N Signal Plus |
Blasticidin S |
20 μg |
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pCAG-Neo PA 標(biāo)簽-C pCAG-Hyg PA tag-C |
Hygromycin B |
20 μg |
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pCAG-Hyg PA 標(biāo)簽-N 信號(hào) 增加型 pCAG-Hyg PA tag-N Signal Plus |
Hygromycin B |
20 μg |
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pCAG-Neo PA 標(biāo)簽-C pCAG-Neo PA tag-C |
Kanamycin |
G418 |
20 μg |
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pCAG-Neo PA 標(biāo)簽-N 信號(hào) 增加型 pCAG-Neo PA tag-N Signal Plus |
Kanamycin |
G418 |
20 μg |
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◆相關(guān)產(chǎn)品
內(nèi)參照
下表為Western Blot實(shí)驗(yàn)中參照用單抗一覽表。
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產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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抗β肌動(dòng)蛋白單抗 |
免疫化學(xué)用 |
200 μg |
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1 mg |
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5 mg |
|||
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抗β肌動(dòng)蛋白單抗,過(guò)氧化物酶標(biāo)記 Anti β-Actin, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated |
免疫化學(xué)用 |
200 μL |
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|
抗α-微管蛋白, 單抗 Anti α-Tubulin, Monoclonal Antibody |
免疫化學(xué)用 |
10 μg |
|
|
200 μg |
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|
1 mg |
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Anti β-Tubulin,
Monoclonal Antibody |
免疫化學(xué)用 |
10 μg |
|
|
200 μg |
|||
|
1 mg |
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Anti GAPDH, Monoclonal Antibody |
免疫化學(xué)用 |
200 μg |
|
|
1 mg |
|||
|
5 mg |
|||
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Anti GAPDH, Monoclonal Antibody,
Peroxidase Conjugated |
免疫化學(xué)用 |
200 μL |
蛋白酶抑制劑系列
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產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
產(chǎn)品編號(hào) |
包裝 |
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蛋白酶抑制劑混合物試劑盒 I，無(wú)動(dòng)物源成分（通用型） Protease Inhibitor Cocktail Set I, Animal-derived-free (for general use) (×100), Lyophilized |
通用型 |
1 mL用 |
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1 mL用×5 |
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蛋白酶抑制劑混合物試劑盒III, DMSO溶液（不含EDTA）（×100） |
動(dòng)物細(xì)胞 |
1 mL |
|
|
1 mL×5 |
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蛋白酶抑制劑混合物試劑盒V （無(wú)EDTA）（×100） |
2D電泳 |
1 mL |
|
|
1 mL×5 |
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蛋白酶抑制劑混合物試劑盒 VI，DMSO溶液，用于植物（×100） |
植物細(xì)胞 |
1 mL |
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|
1 mL×5 |
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蛋白酶抑制劑混合物試劑盒VII，DMSO溶液，組氨酸標(biāo)簽蛋白（×100） |
His Tag 純化※ |
1 mL |
|
|
1 mL×5 |
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