新型鈣離子熒光探針Fluo-8
鈣在各種細(xì)胞中充當(dāng)通用的第二信使。 生命的開始，受精的行為，是由Ca2 +調(diào)節(jié)。 所有類型細(xì)胞的許多功能由Ca 2+或多或少地調(diào)節(jié)。 自從20世紀(jì)20年代，科學(xué)家們試圖測量Ca2 +，但由于Ca2 +探針的有限性，很少有人成功。 首先Ridgway和Ashley通過將發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白注射到巨人體內(nèi)來進(jìn)行可靠的Ca2 +測量藤壺的肌纖維。 隨后，在20世紀(jì)80年代，Tsien及其同事制作了各種熒光指示劑。其中基于熒光素的Ca2 +試劑（如Fluo-3和Fluo-4）提供了值得信賴的方法。測量Ca2 +。 由于這些Ca2 +探針的發(fā)展，對Ca2 +的研究相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)象已近飆升。
Fluo-8?鈣指示劑，最亮的鈣染料
自引入以來，Fluo-3成像及其類似物（如Fluo-4）揭示了Ca2 +信號傳導(dǎo)中許多基本過程的空間動(dòng)力學(xué)。 Fluo-3和Fluo-4也已廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)和基于微孔板（如FLIPR?）的鈣檢測。 然而，弱信號和苛刻的染料加載條件限制了它們在某些細(xì)胞分析中的應(yīng)用。 我們開發(fā)了Fluo-8?系列鈣檢測試劑，以解決Fluo-3和Fluo-4的這些局限性。
Fluo-3和Fluo-4在細(xì)胞應(yīng)用中最重要的特性是它們的吸收光譜與氬離子激光源在488nm激發(fā)相容，并且響應(yīng)Ca2 +結(jié)合的熒光強(qiáng)度增加非常大。我們的Fluo-8?Ca2+檢測試劑保留了這兩個(gè)有價(jià)值的特性。 Fluo-8?試劑的吸收峰和發(fā)射峰分別為490 nm和514 nm。它們可以用488nm的氬離子激光很好地激發(fā)，并且它們發(fā)射的熒光（波長514nm）隨著Ca2 +的增加而增加。 Fluo-8?在與Ca2 +結(jié)合后確定熒光增加> 200倍。由于刺激后許多細(xì)胞中Ca2 +的增加范圍通常為5至10倍，因此Fluo-8?是該區(qū)域中高靈敏度使用的優(yōu)異探針.Fluo-8?的Kd估計(jì)為389 nM （22℃，pH7.0-7.5），但該值可能受pH，粘度和體內(nèi)條件下結(jié)合蛋白的顯著影響。
除了方便的488 nm激發(fā)波長和鈣的大熒光增強(qiáng)外，Fluo-8?在細(xì)胞中比Fluo-3和Fluo-4更亮，如圖1所示。此外，Fluo-8?更容易裝入 比Fluo-3和Flu-4活細(xì)胞，兩者都需要37°C才能獲得最佳的細(xì)胞負(fù)載。 Fluo-8?試劑具有較低的溫度依賴性細(xì)胞負(fù)載特性，在室溫或37°C下也能得到相似的結(jié)果。 這一特性使Fluo-8?更適合HTS應(yīng)用。
表1.Fluo-8?鈣檢測試劑的光譜和Ca2 +結(jié)合特性
與Fluo-3和Fluo-4相比，我們的Fluo-8?鈣檢測試劑具有以下優(yōu)勢：
·1、方便的波長：最大激發(fā)波長@ 490 nm; 最大發(fā)射@ ~514 nm。
·2、增強(qiáng)強(qiáng)度：比Fluo-4 AM亮2倍; 比Fluo-3 AM亮4倍。
·3、加載速度更快：在室溫下加載染料（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）。
·4、多功能Ca2 + - 結(jié)合Kd，如表1所示。
·5、多功能包裝尺寸，滿足您的特殊需求：1毫克; 10x50μg; 20x50μg; HTS包。
圖1.將U2OS細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與37μC，5％CO2培養(yǎng)箱中的濃度為4μM的100μLFluo-3AM，Fluo-4AM和Fluo-8?AM在HHBS中孵育。 持續(xù)1小時(shí)。 將細(xì)胞用200μLHHBS洗滌兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（OlympusIX71）成像。
使用Fluo-8?AM酯類
1.使用Fluo-8?AM酯的稱重傳感器：
AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。 DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)該穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將Fluo-8?AM酯加入活細(xì)胞的方案。 該步驟僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Fluo-8?AM酯原液。
b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Fluo-8?溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覂?nèi)溫度。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您的緩沖液中準(zhǔn)備1到10μM的工作溶液選擇0.02％Pluronic?F-127。對于大多數(shù)細(xì)胞系，Fluo-8?試劑的濃度范圍為4-5 uM。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用最小染料濃度可以產(chǎn)生足夠的信號強(qiáng)度。
注意：非離子型洗滌劑Pluronic?F-127有時(shí)用于增加Fluo-8?AM的水溶性酯。各種Pluronic?F-127解決方案可從AAT Bioquest購買。
c）如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM）可能是添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以減少脫酯化指示劑的泄漏。
注意：可以購買各種ReadiUse?丙磺舒，包括水溶性鈉鹽和穩(wěn)定溶液
d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。
e）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱或室溫下孵育20分鐘至1小時(shí)。
注意：降低加載溫度可能會(huì)減少指示符的劃分。
f）用您選擇的HHBS或緩沖液替換染料工作溶液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如2.5 mM丙磺舒（如果適用）去除多余的探針。
g）在Ex / Em = 490 / 525nm處進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：見圖1。
使用Screen Quest?Fluo-8 NW鈣測定試劑盒進(jìn)行HTS應(yīng)用
可以通過直接測量受體介導(dǎo)的cAMP積累或改變細(xì)胞內(nèi)Ca 2+濃度來檢測GPCR活化。通過Gq偶聯(lián)的GPCR靶標(biāo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的增加，可以使用Fluo-8 試劑和熒光酶標(biāo)儀的組合測量。熒光成像平板讀取器（例如，FLIPR ，FDSS或BMG NovoStar ）具有冷卻的CCD相機(jī)成像系統(tǒng)，其同時(shí)收集來自微孔板（96和384孔）的每個(gè)孔的信號。這些讀板器可以亞秒間隔讀取，這使得能夠捕獲響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，并且具有可以對連續(xù)液體添加進(jìn)行編程的集成移液器。除了它們對GPCR靶標(biāo)的強(qiáng)大應(yīng)用外，我們的Screen Quest Fluo-8鈣測定試劑盒也可用于表征鈣離子通道和篩選鈣離子通道靶向化合物。
圖2.使用Screen Quest Fluo-8 NW測定試劑盒和Fluo-4 NWAssay試劑盒在HEK-293細(xì)胞中測量卡巴膽堿劑量反應(yīng)。將HEK-293細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與100μL的Screen Quest一起孵育 ] Fluo 8-NWcalcium測定試劑盒和Fluo-4 NW試劑盒（根據(jù)制造商的說明書）在室溫下保持1小時(shí)。通過NOVOstar（BMG LabTech）添加卡巴膽堿（25μL/孔）以達(dá)到最終指示的濃度。 Fluo-8NW的EC50約為1.2 uM。
與Fluo-3或Fluo-4的其他商業(yè)鈣測定試劑盒相比，我們的Screen Quest鈣測定試劑盒在HTS應(yīng)用中具有以下優(yōu)勢：
·廣泛的應(yīng)用：與GPCR和鈣通道目標(biāo)一起使用。
·方便光譜波長：最大激發(fā)波長@ 490 nm;最大發(fā)射@ ~514 nm。
·靈活的染料負(fù)載：室溫下染料負(fù)載（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）。
·無需清洗，無淬火干擾您的目標(biāo)。
·強(qiáng)大的性能：啟用鈣測定使用Fluo-4 AM或Fluo-3 AM是不可能的。
·最強(qiáng)信號強(qiáng)度：比Fluo-4 AM亮2倍;比Fluo-3 AM亮4倍。
使用Fluo-8?鹽
鈣校準(zhǔn)可以通過測量具有精確已知的游離Ca 2+濃度的溶液中的指示劑的鹽形式（熒光微板讀數(shù)器中25至50μM）的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行。 可以使用基于30mM MOPS EGTA Ca2 +緩沖液的校準(zhǔn)溶液。 通常，水含有微量的鈣離子。 強(qiáng)烈建議使用30 mM MOPS + 100 mM KCl，pH 7.2作為緩沖系統(tǒng)。 人們可以簡單地制作如下所列的0和39μM鈣原液，這兩種溶液用于制備不同Ca2 +濃度的連續(xù)溶液
A. 0 μM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA
B. B. 39 μM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA + 10 mM CaCl2
要確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：
[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]
其中F是在特定實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光強(qiáng)度，Fmin是不含鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度，Fmax是鈣飽和探針的熒光強(qiáng)度。
解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的鈣結(jié)合和光譜特性在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。通過在存在的離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素的情況下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。或者，細(xì)胞透化劑如digitoninor Triton X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。Fluo-8試劑的Kd值列于表1中供您參考。
結(jié)論
由于Ca2+在生物學(xué)中的重要性，已經(jīng)建立了許多用于分析細(xì)胞和/或亞細(xì)胞Ca 2+活性機(jī)制的技術(shù)/方法。然而不幸的是，沒有一種可以測量Ca 2+的最佳技術(shù)/方法。 盡管用于分析Ca2+活性的每種方法都具有優(yōu)于其他方法的某些優(yōu)點(diǎn)，但每種方法也存在缺點(diǎn)。憑借上述出色的性能，我們相信Fluo-8?鈣檢測試劑和Screen Quest?Fluo-8NW鈣測定試劑盒為各種生物系統(tǒng)中的細(xì)胞內(nèi)鈣分析和監(jiān)測提供了新的強(qiáng)大工具，與熒光儀器的快速發(fā)展相結(jié)合。
正如可能預(yù)測的那樣，許多研究人員的興趣從細(xì)胞水平的Ca2 +分析轉(zhuǎn)向亞細(xì)胞水平。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ca2 +在整個(gè)細(xì)胞中均勻分布，并且在多種細(xì)胞（例如，卵母細(xì)胞，心肌細(xì)胞，肝細(xì)胞和外分泌細(xì)胞）中觀察到Ca2 +的細(xì)胞內(nèi)異質(zhì)性（例如Ca2 +波和Ca2 +火花）。）。 隨著20世紀(jì)80年代共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和2000年代先進(jìn)的酶標(biāo)儀（如FLIPR，FDSS和NOVOStar專用于細(xì)胞內(nèi)Ca2 +檢測）的出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的測量顯著加速。 共聚焦激光掃描顯微鏡，以及最近的多光子顯微鏡，除了測量其濃度外，還允許在亞細(xì)胞水平上對細(xì)胞內(nèi)Ca 2+活性進(jìn)行精確的空間和時(shí)間分析。
參考文獻(xiàn)
1. Alkhaldi, Jan Martinek , Brian Panicucci, Christophe Dardonville, Alena Zíkova, Harry P. de Koning. Trypanocidal action of bisphosphonium salts through a mitochondrial target in bloodstream form Trypanosoma brucei. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance 6 (2016) 23e34.
2. Takahiro Shibata, Katsuhiro Takahashi, Yui Matsubara, Emi Inuzuka, Fumie Nakashima, Nobuaki Takahashi, Daisuke Kozai, Yasuo Mori & Koji Uchida. Identification of a prostaglandin D2 metabolite as a neuritogenesis enhancer targeting the TRPV1 ion channel. Sci Rep. 2016; 6: 21261. Published online 2016 Feb 16. doi: 10.1038/srep21261. 3. Boris Gourévitchh, Jun Cai, Nicholas Mellen. Cellular and network-level adaptations to in utero methadone exposure along the ventral respiratory column in the neonate rat. Experimental Neurology. Available online 20 March 2016.
3. Aditya J. Desai, Maoqing Dong, Laurence J. Miller. Beneficial effects of β-sitosterol on type 1 cholecystokinin receptor dysfunction induced by elevated membrane cholesterol. Clinical Nutrition. Available online 15 March 2016.
4. Wiktor S. Phillips, Mikkel Herly, Christopher A. Del Negro, and Jens C. Rekling . Organotypic slice cultures containing the preBo?tzinger complex generate respiratory-like rhythms. J Neurophysiol. 2016; 115:1063-1070.
5. Jin-Feng Zhao, Song-Kun Shyue, and Tzong-Shyuan Lee. Excess Nitric Oxide Activates TRPV1-Ca2+ -Calpain Signaling and Promotes PEST-dependent Degradation of Liver X Receptor α. Int J Biol Sci. 2016; 12(1): 18–29. doi: 10.7150/ijbs.13549.
6. Robert A. Volkmann, Christopher M. Fanger, David R. Anderson, Venkata Ramana Sirivolu, Kathy Paschetto, Earl Gordon, Caterina Virginio, Melanie Gleyzes, Bruno Buisson, Esther Steidl, Susanna B. Mierau, Michela Fagiolini, Frank S. Menniti . MPX-004 and MPX-007: New Pharmacological Tools to Study the Physiology of NMDA Receptors Containing the GluN2A Subunit. Plos one. Published: February 1, 2016. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0148129.
7. Retsu Mitsui , Hikaru Hashitani. Mechanisms underlying spontaneous constrictions of postcapillary venules in the rat stomach . Pflügers Archiv - European Journal of Physiology, Muscle Physiology, February 2016, Volume 468, Issue 2, pp 279-291.