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免疫印跡Western bloting
這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體（NC、PVDF膜），并以特異性抗體作為探針檢測(cè)之?？贵w與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行定性、分析。
材料（MATERIALS）
o 試劑（REAGENTS）
1.0 M Tris-Hcl（PH6.8）
1.5 M Tris-HCl（PH8.8）
10% AP（不要配太多）
10% SDS
30% Acr
20% Tween20
10 mM PMSF
0.2 M NaH2PO4
0.2 M Na2HPO4
TBST
轉(zhuǎn)移膜
化學(xué)發(fā)光試劑
轉(zhuǎn)移緩沖液（TB buffer）
電泳緩沖液（EB buffer）
PBS緩沖液
10×麗春紅染液
封閉液（5% 脫脂牛奶）
濾紙
SDS 上樣緩沖液
o 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
裂解液中加入終濃度為1 mM的PMSF，離心機(jī)預(yù)冷，PBS預(yù)冷，TB buffer 4℃預(yù)冷，
o 器械（EQUIPMENT）
垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、脫色搖床、搪瓷盤、蛋白電泳裝置、勻漿器
實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）
蛋白樣品制備 預(yù)計(jì)時(shí)長(zhǎng)：1h
(一) 貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：
1. 按1 ml裂解液加10μl PMSF（100 mM）混勻后置于冰上。
2. 吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS洗兩次后，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目加入相應(yīng)體積的裂解液搖勻于冰上裂解30 min（60 mm皿加1 ml）期間可搖動(dòng)混勻。
3. 裂解完成后，用槍頭將細(xì)胞刮掉然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。
4. 2-3步也可為：加入裂解液靜置兩分鐘后刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，用超聲破碎細(xì)胞。
5. 12000 g × 5 min 4℃離心后，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
6. -20℃保存或進(jìn)行下一步。
(二) 懸浮細(xì)胞總蛋白的提取
1. 將培養(yǎng)基倒至15 ml離心管中，800 g × 5 min 4℃離心，吸出培養(yǎng)基，加入2 ml 4℃預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞后再次800 g × 10 min 4℃離心，盡量吸干PBS，加入裂解液冰上裂解30min，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
2. 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進(jìn)行下一步。
(三) 組織中總蛋白的提取
1. 將組織塊盡量剪碎，加入含PMSF的裂解液于勻漿器中，進(jìn)行勻漿然后置于冰上。
2. 幾分鐘后，再次勻漿，置于冰上。如此反復(fù)幾次使組織盡量碾碎。
3. 裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml EP管 中，12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進(jìn)行下一步。
蛋白質(zhì)定量
一般選擇BCA或者Bradford方法，具體方法見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書。BCA要求檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm，Bradford為595 nm。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬斯G250混合看是否產(chǎn)生顏色。具體測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50-100 ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個(gè)泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug）。
(一) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1. 從-20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
2. 取18個(gè)1.5 ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0 μg。
3. 按下表在各管中加入各種試劑。
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|
0 μg |
2.5 μg |
5 μg |
10 μg |
20 μg |
40 μg |
|
1 mg/ml BSA |
|
2.5μl |
5μl |
10μl |
20μl |
40μl |
|
0.15 M NaCl |
100μl |
97.5μl |
95μl |
90μl |
80μl |
60μl |
|
G250 溶液 |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
(二) 檢測(cè)樣品蛋白含量
1. 取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測(cè)蛋白。
2. 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 M NaCl 100μl，混勻放置2 min 可作為空白樣品，將空白倒入比色皿中做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線程序下按Blank測(cè)空白樣品。
3. 棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗bisemin2次，用無(wú)菌水洗一次。
4. 取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15 M NaCl 溶液和5μl 待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2 min后測(cè)量。
SDS-PAGE電泳 預(yù)計(jì)時(shí)長(zhǎng)：3.5h
（一）灌膠與上樣
1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏液，然后用濾紙將水吸干）。
2. 選擇合適的分離膠濃度配置，注意最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過(guò)硫酸銨。灌膠時(shí)膠要沿玻璃板流下，否則膠中易有氣泡（濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水或異丙醇，（加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。注意給濃縮膠留出足夠的空間（推薦長(zhǎng)度為插入的梳齒長(zhǎng)再加1cm）
3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)說(shuō)明膠已凝了，一般需半個(gè)小時(shí)（氣溫高會(huì)快些）。倒去膠上層水或異丙醇并用吸水紙吸干或放倒靜置幾分鐘將水流干。AP不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，必要時(shí)可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會(huì)超過(guò)1h
4. 配制濃縮膠，方法與操作同分離膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中，避免膠與梳子之間有氣泡。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。
SDS-PAGE配方
|
分離膠 |
15% |
12% |
10% |
8% |
6% |
濃縮膠 |
5% |
|
ddH2O |
1.76ml |
2.64 ml |
3.2 ml |
4.6 ml |
4.24 ml |
ddH2O |
3.4 ml |
|
30%丙烯酰胺 |
4ml |
3.2 ml |
2.64 ml |
2.6 ml |
1.6 ml |
30%丙烯酰胺 |
0.83 ml |
|
1.5M Tris-Hcl（8.8） |
2ml |
2 ml |
2 ml |
2.6 ml |
2 ml |
1.0M Tris-Hcl（6.8） |
0.63 ml |
|
10% SDS |
80μL |
80μL |
80μL |
80μL |
80μL |
10%SDS |
50μL |
|
10% APS |
80μL |
80μL |
80μL |
80μL |
80μL |
10%APS |
50μL |
|
TEMED |
3.2μL |
3.2μL |
3.2μL |
3.2μL |
3.2μL |
TEMED |
5μL |
▲關(guān)鍵步驟：
1. 過(guò)硫酸銨用量很少，且易變質(zhì)，一次不要配太多，最多不超過(guò)兩周。
2. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。
（二）上樣、電泳
1. 測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至1.5 ml離心管中，加入5 × SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過(guò)15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品100 ℃ 5 min使蛋白變性。
2. 濃縮膠電泳電壓為110 V，當(dāng)樣品在濃縮膠、分離膠交界處被壓為一條線時(shí)，電壓調(diào)為130 V
轉(zhuǎn)膜 預(yù)計(jì)時(shí)長(zhǎng)：3h
1. 在電泳結(jié)束前20 min開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張的濾紙（長(zhǎng)一般為8.1~8.3 cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實(shí)際測(cè)量，但膠一般會(huì)縮水，所以裁8cm就行）和1張NC或PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF膜使用前用無(wú)水甲醇中浸泡1 min-2 min，NC膜不需要。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
2. 將玻璃板撬開后，輕輕刮去濃縮膠，用蒸餾水沖洗干凈。取出凝膠后可以在右上角裁一個(gè)小角以區(qū)分上下左右。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來(lái)，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜。
3. 在陶瓷盆中倒入TB buffer，放入浸過(guò)甲醇的PVDF膜平衡10 min。帶上手套，將夾子打開使黑的一面平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上墊一張海綿墊、疊放3張浸泡過(guò)緩沖液的濾紙、剛剛完成電泳的凝膠、PVDF膜（此時(shí)可在膜右上角減去一個(gè)角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、和另外3張浸泡過(guò)緩沖液的濾紙、另一個(gè)海綿墊，合起夾子。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。
4. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，所以TB Buffer要在4℃預(yù)冷，轉(zhuǎn)移槽要放在冰水混合泡沫箱中。的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。
5. 轉(zhuǎn)完后將膜用1× 麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖，可回收）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。使用預(yù)染marker話可以看見(jiàn)marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個(gè)顏色來(lái)判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過(guò)頭是不可靠的。
▲關(guān)鍵步驟：操作是要戴手套，否則手上的蛋白會(huì)造成污染。
免疫雜交反應(yīng) 預(yù)計(jì)時(shí)長(zhǎng)：1 Day
1. 封閉：將膜用TBST浸濕，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h即可，注意封閉后不要洗脫，（如果是自己配置的封閉液，最好過(guò)濾一下以消除固體雜質(zhì)）。
2. 一抗孵育： 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以）至適當(dāng)濃度（可以在5 ml EP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:1000，具體按抗體說(shuō)明來(lái)，用后可回收重復(fù)用2-3次， -20℃保存，避免反復(fù)凍融）。
一、二抗孵育有兩種方法：
1） 膜孵：撕下適當(dāng)大小的一塊兒封口膜（也可使用保鮮膜）鋪于培養(yǎng)皿蓋上，使封口膜保持平整，將抗體溶液加到封口膜上，從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡，放于濕盒中，室溫孵育1 h或4℃過(guò)夜孵育。用TBST在室溫下脫色搖床上洗6×5 min。
2）配制5 ml抗體稀釋液于5 ml EP管中，直接將膜放入，4℃過(guò)夜孵育，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5 min。
3. 二抗孵育： 方法同一抗孵育，但一般二抗稀釋比較大1:10000足夠。用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5min。
化學(xué)發(fā)光 預(yù)計(jì)時(shí)長(zhǎng) 10min
化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪一張一次性手套，將轉(zhuǎn)移膜放在手套上，蛋白面向上。將化學(xué)發(fā)光的A液和B液兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（總體積能夠覆蓋住膜就行，注意吸完A液后吸B液要換槍頭，否則整瓶試劑都將報(bào)廢），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)1-2 min后（無(wú)需避光），將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，凝膠圖象分析或X-光片曝光。
X-光片曝光：
1. 將轉(zhuǎn)移膜放在保鮮膜上，把另一側(cè)翻過(guò)來(lái)蓋在其上，把保鮮膜固定在片夾上。
2. 在暗室中，將配好的顯影液和定影液倒入塑料盆中，打開紅色照明燈，取出X光片，剪成比膜稍大，疊放3-4層后放在膜上，不要再移動(dòng)X光片，關(guān)上X片夾，計(jì)時(shí)2-5 min。（多層膠片的目的是找到最合適的曝光度）
3. 時(shí)間完成后，打開片夾，X光片放入顯影液，出現(xiàn)明顯條帶后停止顯影，放入定影液，定影5-10 min至膠片透明。
4. 用水將膠片沖干凈，晾干，觀察結(jié)果。定影液和顯影液可回收，避光室溫放存，但不宜放太久。
▲關(guān)鍵步驟：
1.發(fā)光液的A、B液一定不能相互污染，吸取時(shí)一定要注意換槍頭。
2.發(fā)光液配制好后應(yīng)立即使用。
3.暗室中光線很弱，可暗適應(yīng)一段時(shí)間在開始實(shí)驗(yàn)，拿膠片的時(shí)候避免用指甲滑到，會(huì)有劃痕。
附錄
相關(guān)試劑的配制：
1. 封閉液（5% 脫脂牛奶的TBST緩沖液）
脫脂奶粉 5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過(guò)膜面即可，一次性使用。如不經(jīng)常用，可每次現(xiàn)用現(xiàn)配所需體積。
2. TBST緩沖液（含0.05％ Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. TBS緩沖液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）
1 M Tris-HCl（pH7.5） 10 ml
NaCl 8.8g
蒸餾水至 1000ml
4. 10×麗春紅染液
麗春紅S 2 g
三氯乙酸 30 g
磺基水楊酸 30 g
蒸餾水至 100 ml
使用時(shí)將其稀釋10倍。
5. 轉(zhuǎn)移緩沖液（48 mM Tris，39 mM甘氨酸，0.037％ SDS，20％ 甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次
6. 電泳液緩沖液（25 mM Tris，0.25 M甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3-5次。
7. 1.74 mg/ml (10 mM) PMSF
PMSF 0.174 g
異丙醇 100 ml
溶解后，分裝于1.5 ml離心管中，－20℃保存。
8. 10% SDS
SDS 10 g
蒸餾水至 100 ml
50℃水浴下溶解，室溫保存。
如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
9. 10% 過(guò)硫酸胺（AP）
過(guò)硫酸胺 0.1 g
超純水 1.0 ml
溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周。
10. 30% Acr/Bic
丙稀酰胺（Acr） 29 g
甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1 g
超純水至 100 ml
37℃下溶解后，濾膜過(guò)濾，棕色瓶4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無(wú)沉淀。
11. 20% Tween20
Tween20 20 ml
蒸餾水至 100 ml
混勻后，4℃保存。
12. 0.01 M PBS(PH 7.3)
0.2 M NaH2PO4 19ml
0.2 M Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸餾水至 2000 ml
13. G250 考馬斯亮藍(lán)溶液（測(cè)蛋白含量專用）
G250 100 mg
95% 乙醇 50 ml
磷酸 100 ml
蒸餾水至 1000 ml
先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加水和磷酸，混勻后4℃保存。
14. 100 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 M NaCl 1 ml
溶解后，-20℃保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15 M NaCl 進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存