自1983年經(jīng)典的聚合酶鏈反應(PCR)方法問世以來，核酸擴增技術已滲透到生命科學的各個領域。然而，盡管它的基本范圍，PCR一直被限制在實驗室的墻壁內(nèi)，由于它需要一個復雜的熱循環(huán)機器，限制了在低資源環(huán)境下的外部應用。新的等溫擴增策略正在尋求突破傳統(tǒng)的實驗室界限，提供恒溫核酸復制。在這些方法中，重組酶聚合酶擴增(RPA)是發(fā)展最快的方法之一，盡管它的引入相對較晚，但它的吸收和市場發(fā)展也很快。至關重要的是，RPA的技術增強了實驗室外高度可獲取和敏感的核酸擴增，甚至是自我檢測。在這里，我們?nèi)婊仡櫫?/span>RPA在其發(fā)展的第一個十年中的無設備簡單性。本文綜述了RPA技術的關鍵知識，如其反應成分、機理、靈敏度和特異性以及獨特的檢測方法。該綜述還提供了開發(fā)RPA分析的技術訣竅，以及有關商用RPA反應試劑盒和附件的信息。通過對已發(fā)表文獻的數(shù)據(jù)挖掘，我們總結了關鍵的RPA實驗提示和問題，以幫助研究人員掌握RPA反應。我們還概述了RPA發(fā)展的影響力的熱點，并展望了未來的發(fā)展前景以及對超越PCR和進一步革新生命科學的影響。
簡介及概述
體外核酸擴增(NAA)是遺傳物質(zhì)的人工復制，已滲透到生命科學和生物技術的各個領域，如病原體檢測、癌癥研究、克隆、測序、基因工程、合成生物學、基因分型、誘變、犯罪法醫(yī)鑒定、藥物發(fā)現(xiàn)、分子考古學、食品檢測、健康和生活方式檢測等。這場爆炸性的革命始于1983年Kary Mullis發(fā)明的聚合酶鏈反應(PCR)。從根本上說，PCR是一個循環(huán)過程，通過提供有利于核酸復制過程的連續(xù)溫度(鏈變性、引物退火和酶延伸)，從單個核酸分子到體外數(shù)十億拷貝進行指數(shù)擴增。分子數(shù)量的增加使得核酸的處理和后續(xù)應用變得更加容易，減少了使用有毒放射性探針來跟蹤分子存在的需求，并在應用方面產(chǎn)生了巨大的創(chuàng)造力。然而，盡管PCR很有價值，但需要一個復雜的熱循環(huán)器來提供循環(huán)加熱和冷卻過程，這在很大程度上限制了PCR在實驗室墻壁內(nèi)的實施，阻礙了其在低資源環(huán)境中的應用。
核酸等溫擴增技術的最新進展為人工核酸復制提供了簡化的孵育條件，只需要恒溫而不需要熱循環(huán)。單溫孵育減少了對設備的要求，為突破實驗室的界限開辟了新的途徑，并在資源匱乏的環(huán)境中進行擴增。通過減少放大時間，消除重復加熱和冷卻步驟也為低資源實施提供了第二個優(yōu)勢。更快的反應發(fā)生不僅是因為加熱和冷卻時間的減少，而且還因為多個分子反應可以異步進行，而不是被迫在人工加熱和冷卻循環(huán)中依次進行。自20世紀90年代初以來，大量的等溫核酸擴增方法采用了各種反應機制。最完善的方法包括基于核酸序列的擴增(NASBA，也稱為轉錄介導擴增，TMA)、核糖核酸(RNA)技術的信號介導擴增(SMART)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、滾環(huán)擴增(RCA)、多重位移擴增(MDA)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)和鏈位移擴增(SDA);讀者可以在一些評論中參考這些方法的細節(jié)。2-5特別是重組酶聚合酶擴增(RPA)技術，由于其設備要求簡化和反應時間快，盡管其引入相對較晚，但其發(fā)展迅速，市場份額不斷增加(圖1)。
圖1 RPA首次推出以來的市場份額和出版物數(shù)量匯總。(A): RPA在等溫核酸擴增技術中的市場份額百分比。經(jīng)參考文獻7許可轉載。版權所有2018 Grand View Research, Inc. (B):基于web of science收集的數(shù)據(jù)，2006 - 2017年RPA出版物編號。
RPA最早是在2006年由來自ASM科學有限公司(英國劍橋，由Wellcome Trust Sanger研究所創(chuàng)立)的Niall Armes引入的雖然在等溫核酸擴增技術中，RPA尚未占據(jù)較大的市場份額百分比(根據(jù)大觀研究報告的數(shù)據(jù)，圖7)。1A)，它正經(jīng)歷著最迅速的吸收。到目前為止，已經(jīng)出版了250多份關于RPA的出版物，在過去六年中，RPA出版物的數(shù)量持續(xù)增加;值得注意的是，RPA出版物數(shù)量從2014年開始呈指數(shù)增長(圖1B)。其中，2014 - 2018年連續(xù)發(fā)表了5篇RPA綜述論文。Zaghloul和El-shahat的綜述側重于RPA在丙型肝炎病毒診斷中的應用;Moore和Jaykus的綜述強調(diào)了用于檢測腸道病毒的RPA分析;James和Macdonald,10 Daher等人11和Lobato和O' sullivan的綜述12描述并總結了RPA在護理點(POC)診斷中應用的特點和優(yōu)勢。在此，我們對RPA的自由基性質(zhì)和發(fā)展?jié)摿M行了綜述。首先介紹RPA技術的關鍵方面，即反應成分和機制。隨后，我們提供開發(fā)RPA分析的專業(yè)知識，包括設計和選擇寡核苷酸(引物，探針和模板);還提供了有關市售RPA反應試劑盒和附件的信息。對于那些對RPA的技術實現(xiàn)感興趣的人，我們通過數(shù)據(jù)挖掘已發(fā)表的文獻總結了關鍵的RPA實驗技巧和問題，以幫助研究人員更好地掌握RPA反應。隨后，通過整理數(shù)據(jù)(如RPA文獻中的敏感性和特異性)闡明RPA的臨床/現(xiàn)場表現(xiàn)。我們還描述了一些獨特的RPA檢測方法，為那些誰想要檢測RPA分析信號使用的方法，而不是常用的PCR檢測方法。為了解該技術在超越PCR和突破實驗室界限方面的重要意義，我們討論了RPA的發(fā)展熱點，包括定量RPA、多重RPA反應、移動RPA診斷、微流體集成RPA檢測和一步法RPA檢測。最后，對RPA的未來發(fā)展進行了展望。
重組酶聚合酶擴增(RPA)反應
RPA作為取代PCR的革命性方法的突出之處在于其特定的反應組分(表1)和機理。對于一個成功的RPA分析，細微差別取決于內(nèi)在因素，引物，探針和核酸模板的設計;并且與外部因素有關，如反應溫度和攪拌，對錯配的耐受性，抑制劑和背景DNA。此外，RPA過程中的核酸標記、RPA擴增子清理和擴增后處理也是成功檢測RPA的重要細節(jié)。本節(jié)提供了從RPA文獻中總結的這些實用信息，作為RPA試驗設計的指導。此外，讀者還可以獲得有關市售RPA反應試劑盒和附件的信息(表2和3)。最后，本節(jié)通過對RPA文獻的數(shù)據(jù)挖掘來闡明RPA的臨床/現(xiàn)場表現(xiàn)，這些文獻也被簡潔地整理(表4和5)。
2.1 反應成分
RPA的基本反應機制依賴于對稱為同源重組的自然細胞過程的綜合工程適應，這是DNA代謝的關鍵過程。標準的RPA反應試劑包括三個關鍵蛋白(重組酶、重組酶裝載因子和單鏈結合蛋白)，隨后與輔助成分如脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶、擁擠劑、能量/燃料成分(如三磷酸腺苷、ATP)和鹽分子協(xié)調(diào)，執(zhí)行RPA反應機制(圖2)詳細的反應組分及其典型濃度和作用
2.2 機制
RPA首先與T4 UvsX蛋白(重組酶)結合，在T4 UvsY(裝載因子)的輔助下，與引物結合形成核蛋白絲。由此產(chǎn)生的復合體在雙鏈DNA中尋找同源序列(圖2)。一旦同源性被定位，復合體侵入雙鏈DNA，形成d環(huán)結構。D-loop的一側是雙鏈，引物與模板鏈雜交，引發(fā)鏈交換反應，而D-loop的另一側保持單鏈，即由SSB蛋白(T4 gp32)穩(wěn)定結合未纏繞的互補鏈。隨后，重組酶從核蛋白絲上分解，并立即可用以啟動另一個新的引物鏈置換反應。
引物結合允許DNA聚合酶(Bsu或Sau)從引物末端的游離3 ' -OH開始合成。隨著聚合的繼續(xù)，兩條親本鏈繼續(xù)分離。正向和反向引物的結合使鏈合成在兩個方向上同時發(fā)生，并最終導致擴增的雙鏈DNA呈指數(shù)級積累，由正向和反向引物之間的序列組成。
在RPA過程中，重組酶-引物復合物的形成是d環(huán)形成的速率限制。據(jù)報道，當T4 UvsX蛋白完全包裹引物而不與雙鏈DNA結合時，d環(huán)的形成是最有效的。SSB蛋白和T4 UvsY(連同ATP)已被證明是與T4 UvsX一起合作進行鏈交換反應所必需的蛋白質(zhì)。然而，這兩種蛋白質(zhì)的存在需要更高濃度的T4 UvsX蛋白，而只需要其中一種蛋白質(zhì)的存在。SSB蛋白可以刺激T4 UvsX降解時的鏈交換反應。重要的是，T4 UvsY蛋白中和了SSB蛋白和T4 UvsX之間對引物結合位點的競爭，阻止了SSB結合引物引發(fā)重組事件。當引物濃度較低時，SSB蛋白抑制T4 UvsX蛋白的鏈交換活性。然而，一旦提供T4 UvsY蛋白，T4 UvsY蛋白就能夠侵入覆蓋SSB蛋白的引物，促進T4 UvsX蛋白與引物的結合(從與結合的T4 UvsY蛋白相鄰的位點)，從而取代引物上的SSB蛋白。
2.3Template,primers, probe and their designs 模板，引物，探針設計
RPA最初被證明是DNA的核酸擴增方法6，后來發(fā)現(xiàn)在同一反應管中加入逆轉錄酶(如小鼠白血病病毒(MuLV)逆轉錄酶)也可以作為RNA的模板36，無論何種核酸模板類型，為了有效擴增，推薦的RPA擴增子長度應低于500個核苷酸。大多數(shù)已發(fā)表的RPA論文的擴增子長度在100到250個核苷酸之間，這通常會產(chǎn)生快速有效的擴增。然而，也報道了較短的擴增子(79個核苷酸;37個，94個核苷酸，38 - 40個)和較長的擴增子(1500個核苷酸6和1941個核苷酸)。
與PCR不同，RPA引物的長度相對較長(建議至少為30個核苷酸，但通常在32至35個核苷酸之間)。較短的PCR引物(通常在18到25個核苷酸之間)也可以用于RPA反應，但可能會降低反應速度和靈敏度。Mayboroda等人、Martorell等人、Wang等人和Fuller等人已經(jīng)證明了短鏈PCR引物在RPA中的應用。后兩位作者表明，與PCR相比，RPA中使用的PCR引物具有更高的檢測靈敏度:RPA分別檢測到轉基因GTS 40-3-2大豆的100個DNA拷貝和農(nóng)桿菌的3.5 pg基因組DNA，而基準PCR分別檢測到1000個DNA拷貝和350 pg基因組DNA。
銷售商業(yè)化RPA試劑的公司TwistDx?Ltd(詳見第2.4節(jié)和表2和3)提供了可在RPA反應期間納入的附加探針。TwistAmp?exo探針(通常在46至52個核苷酸之間)和TwistAmp?fpg探針(通常在32至35個核苷酸之間)用于熒光實時檢測(圖3A和B)。這兩個探針通常用熒光團、猝滅劑(例如黑洞猝滅劑)標記，該猝滅劑靠近熒光團，以暫時阻止熒光信號，以及阻斷劑(例如c3間隔劑、磷酸鹽、實時檢測是基于熒光探針在熒光團和猝滅劑之間的堿基位點(也稱為無嘌呤/無嘧啶位點，位于DNA中(較少出現(xiàn)在RNA中)，既沒有嘌呤也沒有嘧啶堿基)上的切割。堿基位點可以是四氫呋喃(THF)或dSpacer (THF的衍生物)或dR基團(基位通過C-O-C連接體的脫氧核糖)。大腸桿菌外切酶III在THF或dSpacer位點切割TwistAmp?外顯子探針，而糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg在dR位點切割TwistAmp?fpg探針(圖3A和B)。酶切后，TwistAmp?外顯子探針可以作為正向引物。然而，由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg蛋白的不同催化模式(β -消除)，TwistAmp?fpg探針不能作為引物，該引物不能產(chǎn)生可擴展的3 ' -OH基團，而是3 ' -磷酸基團。
第三種探針TwistAmp?LF(通常在46到52個核苷酸之間)用于橫向流動條帶檢測(圖3C)。該探針在5 '端被標記(例如用熒光素)，在3 '端有一個阻滯劑，和一個內(nèi)部基礎位點(THF或dSpacer)。Nfo內(nèi)切酶IV在TwistAmp?LF探針的這個基本位點切割，并產(chǎn)生一個可擴展的3 ' -OH基團用于聚合。然而，與大腸桿菌內(nèi)切酶III在RPA反應中降解大部分擴增子不同，Nfo內(nèi)切酶IV產(chǎn)生較慢的信號和不完全裂解以避免擴增子降解(也見2.8節(jié))。因此，TwistAmp?LF探針也可用于選擇凝膠電泳(GE)作為檢測方法的情況。
為了選擇合適的RPA模板，設計引物和探針，用戶可以參考TwistAmp?反應試劑盒手冊中建議的標準，簡而言之：
(1) 建議在模板上選擇核苷酸序列成分相對“均衡”的一個區(qū)域：
? GC 含量在 40% 到 60% 之間
? 重復序列
? 很少正向/反向重復、回文等
應避開特定基因組內(nèi)的重復序列，以保持靶標的唯一性。就這一點而言， 首選序列的確定方法與 PCR 中的方法大致相同。
(2) 引物GC含量應在30% ~ 70%之間，5′端應避免鳥嘌呤長跡，推薦胞苷類;
? 引物大小最小 30，最大 36
? 引物 GC% 最小 20%，最大 70%
? 引物 Tm 最小 50，最大 100
? 最大允許的單核苷酸重復長度（例如“CCCCC”）設定為 5。
(3)引物3′端推薦添加鳥嘌呤和胞苷，以提高性能。從RPA文獻中，進一步建議用戶評估這些寡核苷酸之間的熔融溫度、雜化穩(wěn)定性、二級結構和二聚體形成。特定的軟件，如BioEdit version 7.0.5.3, Primer3, unfold,mFOLD, Oligoanalyzer 3.1 (IDT, Leuven, Belgium)， PrimerQuest軟件(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)和Visual OMP (DNA軟件，MI, USA)已在文獻中用于分析RPA寡核苷酸特性。一種有效的避免引物二聚體形成的方法是采用自回避分子識別系統(tǒng)(SAMRS)，通過在引物中包含SAMRS核苷酸2-氨基嘌呤-2 '脫氧核糖糖苷(A*)、2 ' -脫氧-2-硫胸苷(T*)、2 ' -脫氧肌苷(G*)和n4 -乙基-2 ' -脫氧胞苷(C*)這些SAMRS核苷酸的包含策略性地將天然A對與T(和G對與C)之間的氫鍵單元替換為天然T對與SAMRS A*、天然A對與SAMRS T*、天然A對與SAMRS T*、天然C對與SAMRS C*之間的氫鍵單元。然而，無論SAMRS A*和SAMRS G*核苷酸的濃度如何，它們都不會分別與SAMRS T*和SAMRS C*核苷酸相互作用。在核酸擴增過程中可以避免因引物二聚體而產(chǎn)生的不良產(chǎn)物。52,53這樣的SAMRS系統(tǒng)已經(jīng)被Sharma和他的同事在RPA反應中證明了，并且被證明可以成功地消除RPA假陽性。此外，需要謹慎避免引物和探針之間的重疊，這已顯示出阻礙所需的擴增效率?？偟膩碚f，遵循所描述的指南作為RPA候選寡核苷酸的計算機優(yōu)化設計的起點就足夠了，然而，最終的候選物應該通過RPA反應進行篩選，以選擇適用于特定RPA測定的首選最終寡核苷酸集(例如，TwistDx?Ltd建議設計5個正向和反向引物，以及3個探針)。
2.4 TwistDx?商業(yè)化試劑盒及儀器
2.5 Influence of temperature and agitation溫度和攪拌的影響
為了使RPA反應達到最佳的效率和分析靈敏度，靶序列的選擇以及相應引物和探針的設計是RPA反應的內(nèi)在決定因素，而反應溫度和反應過程中的攪拌是兩個最重要的外在影響因素。
推薦的RPA反應溫度在37°C - 42°C之間，Crannell等和Wang等人也證明了RPA反應可以通過體溫進行，這有利于現(xiàn)場應用。然而，一些研究小組已經(jīng)研究了RPA反應溫度超出推薦范圍的情況。測試的最大溫度范圍為15℃~ 50℃;結果表明，產(chǎn)生陽性結果的邊際反應溫度應大于30℃。然而，Sun等人和Poulton和Webster研究表明，在低至25℃的溫度下，經(jīng)過RPA擴增和隨后的側流條帶檢測，仍然可以產(chǎn)生陽性信號。此外，Lillis等研究表明，環(huán)境溫度對RPA反應也有影響:當環(huán)境溫度低于10℃時，RPA反應是不穩(wěn)定的，但延長反應時間可以提高陽性結果的可得性。這種反應溫度范圍的研究表明，RPA反應不需要精確的溫度控制。
雖然反應溫度為RPA酶提供了合適的工作環(huán)境，但攪拌增加了均相反應溶液中RPA組分之間的相互作用。TwistDx?建議用戶執(zhí)行RPA反應的兩次混合步驟，一次在反應開始時，另一次在反應4分鐘后。前者是將所有的RPA試劑混合在一起引發(fā)反應，后者是防止反應試劑的局部耗竭，從而提高反應收率。Wambua等人報道，當攪拌4分鐘后形成時，在5-8分鐘內(nèi)達到閾值熒光值，而在沒有攪拌的情況下達到可檢測水平的時間為8 - 14分鐘。此外，不斷震動的RPA反應貫穿始終進一步加快了RPA反應速度，獲得了更穩(wěn)定的陽性結果，提高了靈敏度，特別是當模板濃度接近檢測極限時。Kersting等人報道，與推薦的兩次震動相比，持續(xù)震動會在橫向流帶上產(chǎn)生更快、更穩(wěn)定的信號。Kalsi等人也報道了RPA exo分析法中微滴的連續(xù)混合可以縮短出結果的時間，增加熒光并提高靈敏度。此外，Moody等人建立了數(shù)學模型，結果表明，機械攪拌優(yōu)于手動攪拌，可以消除操作員之間的變化，獲得一致的定量實驗結果;然而，理想的混合頻率是化驗依賴，并應確定在反應之前。然而，如果沒有搖晃條件，Lillis等人證明，減少反應體積(例如從50μL到5μL)可以補償搖晃效應，因為較小的體積增加了擴增所需的試劑和寡核苷酸之間的相互作用。
2.6 Tolerability to mismatches, inhibitors and background DNA DNA錯配，抑制劑，背景DNA耐受能力
除了溫度和攪拌外，對錯配，抑制劑和背景DNA的耐受性是有效和靈敏RPA反應的其他重要因素。RPA具有耐受錯配的能力，迄今為止報道的最高的錯配受體能力是在引物和探針結合位點上的9個核苷酸堿基對。研究還表明，引物5′端或中心的錯配對RPA反應的影響較小，而位于引物3′端的錯配對RPA反應的影響較大。這與RPA反應機制一致(見2.2節(jié))，因為聚合酶從3 '端延伸引物和探針(一旦被切割)。這種錯配敏感性在3 '端有用的應用是區(qū)分單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性(SNP)。Yamanaka等人利用這一特性來區(qū)分煙草使用障礙基因的多態(tài)性;當引物的3′端堿基與目標匹配時，DNA聚合酶延伸是有效的，當3 '端堿基不匹配時,而DNA聚合酶延伸是低效的或不存在的。
然而，一般的RPA錯配耐受性(在引物的3 '端之外)可能是有利的，因為它在引物設計高度多態(tài)性靶標時具有一定的靈活性，在這些靶標中，長期保守的靶標區(qū)域很難定位。相反，這種錯配耐受性的退縮是對密切相關物種的非特異性檢測的趨勢。事實上，Patel等人87、Moore等人88和Yang等人69在檢測基孔肯雅病毒、流行性人諾如病毒和豬圓環(huán)病毒2型時，分別觀察到非特異性檢測。
在測試臨床或現(xiàn)場樣品時，在樣品制備和處理步驟中存在或可能引入許多物質(zhì)(例如抑制劑)，這些物質(zhì)可能會干擾核酸擴增。RPA已被證明耐受某些(PCR)抑制劑，包括:(1)血紅蛋白(20 g L?1)、肝素(0.5 U)和尿液(1.25%)對RPA反應沒有影響；62、91 (2)血紅蛋白(50 g L?1)、乙醇(4% v/v)和尿液(高達5%)，它們僅輕微影響反應。62,91,92 然而，在SDS (0.05% v/v)和尿液(10%)的存在下，RPA反應被完全抑制。62,91 還觀察到，當DNA模板濃度接近檢測極限時，RPA反應更容易受到抑制劑的影響。然而，仔細考慮樣品制備和處理步驟的萃取緩沖液或培養(yǎng)介質(zhì)的選擇也很重要，因為這些工作溶液也可能含有潛在的抑制劑。例如，Valasevich和Schneider72發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) DNA提取緩沖液強烈抑制RPA反應。同樣，Liu et al.93發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽胱氨酸肉湯(細菌富集培養(yǎng)基)顯著影響RPA反應，導致大量引物二聚體，導致側流條帶檢測結果假陽性。
除了耐受抑制劑外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴增靶核酸。94 - 97然而，與對抑制劑的耐受性類似，對背景DNA的耐受性也依賴于濃度。Clancy等人97觀察到，當存在400 ng背景人DNA時，RPA反應被顯著抑制，但當存在200 ng背景人DNA時，RPA反應的抑制程度要小得多。Rohrman和RichardsKortum94表明，當存在50份人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)靶DNA時，0.5μg剪切鮭魚精子DNA可以完全抑制RPA，而當存在103份或106份靶DNA時，剪切鮭魚精子DNA僅能抑制2或5μg RPA。此外，Rohrman和Richards-Kortum94還指出，試驗中使用的引物、探針和靶序列會影響最大背景DNA濃度耐受性。當103份HIV-1和惡性瘧原蟲的靶DNA存在時，2μg剪切鮭魚精子DNA分別完全抑制了HIV-1和惡性瘧原蟲的RPA檢測，然而當存在相同數(shù)量的目標DNA(103份)時，溶組織內(nèi)阿米巴和十二指腸賈第鞭毛蟲分別僅被1μg和0.5μg剪切的鮭魚精子DNA完全抑制94。
2.7 Nucleic acid labelling during RPA RPA過程中的核酸標記
多種下游RPA應用(例如側流條帶檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定)的一個重要過程是在RPA反應期間將標簽納入核酸模板中，以便納入的標簽允許捕獲，檢測和/或協(xié)助RPA分析的信號生成。這種核酸標記可以末端使用5 '標記的引物或內(nèi)部通過標記的核苷酸來實現(xiàn)。39,40,98 - 104用于核酸標記的標簽可以是熒光實體(例如熒光素)、配體(例如生物素)或甚至是核苷酸的短片段(懸垂)。大多數(shù)使用RPA的末端核酸標記都使用5 '標記的正向和反向引物，這樣擴增子具有雙重標記，可以在下游檢測中被相應的識別分子捕獲和檢測。然而，RPA僅通過5 '標記過程耐受某些標簽。Crannell et al.105報道了5種不同的5 ' -標記(Cy5、Cy3、溴脫氧尿嘧啶、四氯熒光素和六氯熒光素)與3種5 ' -標記(Alexa Fluor488、熒光素和地高辛)成功結合的RPA失敗案例。
對于RPA過程中的內(nèi)部核酸標記，反應混合物可以補充標記的核苷酸，主要是使用地高辛- dutps，在聚合酶延伸過程中隨機替代dTTPs來產(chǎn)生標記的擴增子。101-104與末端標記相比，內(nèi)部標記允許將更多的標記并入單個核酸模板，從而在下游分析中具有更多的結合機會。然而，當下游應用于三明治分析時，末端標記可能是一個更好的選擇，因為通過末端標記結合的兩個標簽相距更遠(由擴增子的長度分開)，如果標簽靠得太近，這可以防止結合的空間位阻。
2.8,Amplicon,clean-up,and,post-amplification treatment擴增子的純化和擴增后處理
上述問題考慮了RPA反應前和反應時的條件。此外，反應后處理流程對于成功檢測RPA信號至關重要，應根據(jù)RPA擴增子的預期用途來確定。RPA擴增子的產(chǎn)生依賴于RPA反應試劑盒。使用TwistAmp?Basic試劑盒(也稱為Basic RT試劑盒)從正向和反向引物中產(chǎn)生單個擴增子。相反，使用TwistAmp?exo試劑盒(也包括exo RT試劑盒)和TwistAmp?fpg試劑盒不會產(chǎn)生單個擴增子，前者是由于反應混合物中存在的外切酶在RPA反應中消化了大部分擴增子42，后者是由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg裂解產(chǎn)生不可擴展的3 ' -磷酸基(參見第2.3節(jié))46，然而，對于TwistAmp?nfo試劑盒，由于DNA聚合酶對探針引物模板的置換活性，產(chǎn)生了兩種類型的擴增子:雙標記擴增子作為探針和其中一種引物的短產(chǎn)物出現(xiàn)，而單標記擴增子作為正引物和反向引物的長產(chǎn)物出現(xiàn)(圖3C)(注意，在基于夾心法的橫向流條檢測的測試區(qū)域中，只有雙標記產(chǎn)物會產(chǎn)生陽性信號)105 - 108。
然而，RPA擴增子最初與蛋白質(zhì)和擁擠劑相關，由此產(chǎn)生的DNA -蛋白質(zhì)-擁擠劑復合物阻止了直接使用DNA分子進行凝膠電泳檢測。109,110這是因為這些復合物影響了凝膠電泳中擴增子的正確遷移，導致凝膠上的團塊涂片。在凝膠電泳檢測之前，文獻中已經(jīng)報道了幾種方法來處理RPA擴增子，這些方法包括通過加熱(65°C或95°C 10分鐘)和洗滌劑處理(例如十二烷基硫酸鈉，SDS)使蛋白質(zhì)變性，酶切(例如proteinase K)，通過高速離心使蛋白質(zhì)沉淀，并使用商業(yè)DNA清理試劑盒進行純化。其中加熱法與蛋白酶K消化法或SDS處理法的效果相當。109,111然而，在65℃下加熱10分鐘比在更高溫度下(95℃)加熱效果更好。SDS處理(在上樣緩沖液中占20%)產(chǎn)生的凝膠帶比蛋白酶K消化法(0.2 mg mL - 1或20 mg mL - 1)產(chǎn)生的凝膠帶更亮、更厚109;而在Londono和同事的研究結果中，65°C 加熱10分鐘產(chǎn)生的凝膠帶的亮度與SDS處理方法(在上樣緩沖液中占5%或10%)產(chǎn)生的凝膠帶相當。Kapoor及其同事表明，SDS處理方法(在加載緩沖液中占5%)比加熱方法(65°C 10分鐘)產(chǎn)生更亮的凝膠帶，但也導致靶帶上方出現(xiàn)涂片樣圖案。111,112與加熱、蛋白酶K消化和SDS處理方法相比，使用商業(yè)化DNA清理試劑盒只產(chǎn)生目標條帶，但條帶強度低得多。此外，作為一種替代方法，離心(3分鐘)對顆粒RPA蛋白的性能與加熱方法(65°C,10分鐘)相當。
與橫向流動條帶檢測一樣，可以直接使用RPA擴增子，但建議在運行條帶之前用運行緩沖液(例如1/100稀釋)稀釋擴增子，以(1)提高其吸濕性能114和(2)避免“鬼帶”效應。45,54,115 - 117值得注意的是，Powell及其同事指出，通過替換高分子量PEG (5.5% 35 kDa;114 .另見2.1節(jié))，在RPA試劑配方中使用低分子量PEG (6.5% 3 kDa)。此外，Powell及其同事還開發(fā)了一種方法，以減輕橫向流動條帶檢測的稀釋步驟。他們發(fā)現(xiàn)，有時RPA擴增子在“RPA微球”中不可用（核酸擴增的核心包含局部的RPA試劑圖5A）。其形成與PEG高度相關，用于結合到側流條測試線上。然而，使用雙標記探針(兩個標簽通過短長度連接物連接)可以在酶切后從“RPA球”中逃逸，允許擴增子準備好進行下游三明治檢測(圖5B)114。
2.9 Sensitivities and specificities靈敏性和特異性
RPA的靈敏性和特異性可分為兩類，即分析性和臨床(或現(xiàn)場)。分析靈敏度表示測定法可以檢測到的最低分析物量(也稱為檢測限);分析特異性是一種分析方法測量樣品中一種特定分析物而不是其他分析物的能力。118 臨床敏感性是臨床陽性樣本的正確檢出百分比，而臨床特異性是臨床陰性樣本的正確檢出百分比。
從分析靈敏度和特異性的角度來看，RPA非常敏感，可以檢測到少量被分析物的分子(拷貝)，接近PCR的分析靈敏度(表5)。此外，RPA也可以實現(xiàn)超靈敏的檢測，甚至可以檢測到單個被分析物的拷貝(表4)。在大多數(shù)情況下，RPA對于將一個物種與其他非密切相關的物種區(qū)分開來是非常特異性的。這些酶進行同源性定向修復的天然功能成為RPA區(qū)分近緣物種的缺點，特別是當這些物種具有高序列相似性時。69,87,88相反，這表明RPA可以在一定程度上容忍引物或探針與目標序列的不匹配(詳見2.6節(jié))。
除了測量分析靈敏度和分析特異性外，許多研究者還將RPA應用于臨床或現(xiàn)場樣品的檢測，并將結果與標準方法(多為PCR)進行比較。從總結表5可以看出，RPA的臨床敏感性僅為基準法的一半，而RPA的臨床特異性大部分時間與基準法相當。這些結果表明，RPA可能(僅在某些情況下)誤檢陽性樣本(假陰性)，但不太可能顯示假陽性?？傊?，RPA仍處于臨床/現(xiàn)場試驗評價的初期，尚未成熟到可以作為臨床/現(xiàn)場常規(guī)試驗。