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2022年5月起，猴痘疫情在世界范圍內(nèi)迅速傳播，截至2023年10月6日，已有115個(gè)國(guó)家向世衛(wèi)組織報(bào)告了9萬(wàn)余例確診病例和157例死亡病例。2023年6月以來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份先后報(bào)告1000余例猴痘確診病例，引發(fā)新增本土續(xù)發(fā)疫情和隱匿傳播的較高風(fēng)險(xiǎn)。
        猴痘是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患病，與天花病毒（VARV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VACV）同屬痘病毒科正痘病毒屬。自20世紀(jì)80年代在世界范圍內(nèi)根除天花后，MPXV成為人類最關(guān)注的正痘病毒。由于正痘病毒屬表面蛋白具有較高的同源性（>90%），以VACV或改良牛痘病毒為基礎(chǔ)的天花疫苗產(chǎn)生的中和抗體可以持續(xù)數(shù)十年，對(duì)猴痘提供約85%的交叉保護(hù)作用。
       然而，自從世衛(wèi)組織1980年宣布消滅天花后，大多數(shù)國(guó)家終止了常規(guī)的天花疫苗接種，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)相當(dāng)一部分人群對(duì)猴痘病毒缺乏免疫力。此外，在接種天花疫苗的人群中，其保護(hù)作用也會(huì)隨著時(shí)間的推移而緩慢衰減，從而增加了感染猴痘病毒的風(fēng)險(xiǎn)。
      鑒于國(guó)內(nèi)的猴痘疫情和快速增加的猴痘病例，需要在發(fā)病早期快速甄別出陽(yáng)性病例，并指導(dǎo)后續(xù)的防治策略和疫情防控。猴痘病毒的檢測(cè)可通過(guò)病毒培養(yǎng)和分離鑒定、電子顯微鏡、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫熒光檢測(cè)等技術(shù)方法進(jìn)行。猴痘病毒培養(yǎng)和分離鑒定為確證試驗(yàn)，但猴痘的培養(yǎng)只能在生物安全III級(jí)實(shí)驗(yàn)室由受過(guò)相關(guān)安全程序培訓(xùn)的具有相應(yīng)準(zhǔn)入資質(zhì)、并具有豐富病毒分離培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行，但病毒分離陽(yáng)性率低，需耗時(shí)數(shù)天。不建議將病毒分離作為常規(guī)檢測(cè)和診斷程序。電子顯微鏡可用于評(píng)估樣本中潛在的猴痘病毒。但電子顯微鏡需要專門的專業(yè)技術(shù)人員，技術(shù)要求較高，且對(duì)樣本中病毒顆粒的濃度要求較高。
因此，由于所需的高技術(shù)技能和設(shè)施，這種方法并不常規(guī)用于猴痘病毒的檢測(cè)。其他檢測(cè)方法，如血清中和試驗(yàn)、凝膠沉淀、免疫熒光試驗(yàn)等，雖然也具有一定的診斷價(jià)值，但操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，不適合作為猴痘病毒的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
      目前，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)是首選的猴痘檢測(cè)方法，其中實(shí)時(shí)PCR（qPCR）技術(shù)是猴痘病毒檢測(cè)和分型最有效的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、通量大。但目前針對(duì)猴痘的PCR檢測(cè)試劑存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性差、操作繁瑣、與其它正痘病毒存在交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)等缺陷。而且，猴痘病毒感染潛伏期較長(zhǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子診斷方法對(duì)樣品采集、實(shí)驗(yàn)操作人員及配套檢測(cè)設(shè)備有較高要求，無(wú)法保證快速鑒別感染者。目前沒(méi)有可以廣泛使用的商業(yè) PCR檢測(cè)試劑盒。因此，針對(duì)猴痘病毒有效的快速、靈敏、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法亟需建立。
      2023年10月16日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐課題組在 Cell Reports Methods 期刊發(fā)表了題為：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究論文。
該研究建立了一種快速精準(zhǔn)的猴痘病毒檢測(cè)方法，通過(guò)將等溫?cái)U(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測(cè)體系聯(lián)合，可以實(shí)現(xiàn)猴痘病毒DNA在30分鐘內(nèi)的快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度1個(gè)拷貝數(shù)，同時(shí)能夠精準(zhǔn)區(qū)分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的實(shí)用價(jià)值。

研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了兩個(gè)crRNA的檢測(cè)體系池，其中一組靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守區(qū)D6R和E9L，可以檢測(cè)所有的正痘病毒；另外一組靶向猴痘病毒特有的區(qū)域N3R和N4R。通過(guò)對(duì)crRNA的設(shè)計(jì)和篩選，建立了基于CRISPR/Cas12a的熒光報(bào)告體系（圖1）。

圖1：CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的建立及crRNA的篩選
進(jìn)一步針對(duì)選擇的crRNA，分別檢測(cè)不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒模板以及病毒DNA模板，觀察到CRISPR-Cas12a單獨(dú)檢測(cè)體系的檢測(cè)限約為108拷貝數(shù)，不同crRNA的聯(lián)合可以將檢測(cè)限提高到107拷貝數(shù)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了正痘病毒與猴痘病毒的區(qū)分。并且為了實(shí)現(xiàn)最低檢測(cè)限，研究團(tuán)隊(duì)團(tuán)隊(duì)將等溫?cái)U(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測(cè)體系聯(lián)合，最終能夠達(dá)到1個(gè)拷貝的最低檢測(cè)限，大大提高了檢測(cè)體系的靈敏度（圖2）。

圖2：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的實(shí)現(xiàn)1個(gè)拷貝的最低檢測(cè)限
為了驗(yàn)證檢測(cè)體系實(shí)際應(yīng)用的可靠性與準(zhǔn)確性，針對(duì)中國(guó)大陸第一例猴痘病例的拭子樣本進(jìn)行了檢測(cè)。該體系同樣實(shí)現(xiàn)了1個(gè)拷貝數(shù)的最低檢測(cè)限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中檢測(cè)到了猴痘病毒的DNA，證實(shí)了體系應(yīng)用的可靠性。同時(shí)針對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品的檢測(cè)，陰性參考品中未檢測(cè)到猴痘病毒的DNA，進(jìn)一步證實(shí)了檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性（圖3）。

圖3：RPA聯(lián)合CRISPR/Cas12a檢測(cè)體系對(duì)臨床樣本的檢測(cè)
最終為了提高檢測(cè)效率，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系到單管中，大大的縮短了檢測(cè)時(shí)間以及操作步驟。在提取得到待測(cè)DNA后，15分鐘到30分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)樣本的快速檢測(cè)，且靈敏度高達(dá)1個(gè)拷貝數(shù)。相比于傳統(tǒng)熒光PCR的2小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)的靈敏度（圖4）。

圖4：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的優(yōu)化
綜上所述，該研究建立了猴痘病毒的快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，通過(guò)crRNA的篩選建立了一套CRISPR檢測(cè)體系，并聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)了猴痘病毒的快速、靈敏的精準(zhǔn)檢測(cè)。為猴痘病毒的快速診斷提供了有力的技術(shù)支持。
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所助理研究員趙斐、博士生胡亞美、范張玲，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心黃保英為論文共同第一作者。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐研究員、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心譚文杰研究員和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所許豐雯副研究員為論文共同通訊作者，感謝合作者加拿大麥吉爾大學(xué)梁臣教授、北京同仁醫(yī)院房居高教授、北京醫(yī)院艾斌教授的大力支持。該研究獲得了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新工程、科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：

https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00284-9

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