猴痘病毒，這個天花病毒的神秘近親，正在全球范圍內(nèi)肆虐。 迄今已有近8萬人淪陷于其威脅之下。為了及時上報疑似病例并掌握疫情的動態(tài)，快速而精確地檢測猴痘病毒成為每個衛(wèi)生部門的當(dāng)務(wù)之急。
2022年9月，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所研究員Nicolas Berthet、王頌基等在 Viruses 上發(fā)表了一篇題為“Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus”的研究，他們成功研發(fā)出三種可以在20至30分鐘內(nèi)快速、簡便、直觀地診斷猴痘病毒的方法。這些方法不僅與現(xiàn)行的qPCR核酸檢測方法結(jié)果高度一致，而且更加迅速、直接。猴痘是一種臨床癥狀與天花相似，但相對較溫和的疾病，其致死率約為1%—10%。雖然歷史上主要在中非與西非流行，但近些年來，猴痘病毒正日益成為全球關(guān)注的焦點，促使人們深入研究它。MPXV核酸檢測對于監(jiān)測和診斷工作至關(guān)重要，有助于通過積極識別感染病例來減少病毒傳播。目前，用于診斷猴痘的方法主要包括病毒分離、電子顯微鏡和聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）等。MPXV檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)是real-time PCR，因為它具有高靈敏度和特異性。然而，由于設(shè)備和技術(shù)限制，該方法在一些MPXV流行的資源匱乏地區(qū)并不總是可行的。因此，簡單的現(xiàn)場檢測對于快速、方便地診斷MPXV感染至關(guān)重要。
圖1. 實時 RPA 和 RPA-Cas12a 檢測系統(tǒng)的靈敏度
本研究中所報道的檢測方法是基于重組聚合酶對病毒基因組的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行等溫擴(kuò)增，并分別與CRISPR/Cas12、核酸外切酶以及橫向流動試紙條相結(jié)合而開發(fā)的。研究人員使用三種檢測方法對19份提取自中非臨床樣本的DNA進(jìn)行檢測驗證，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測定量PCR的結(jié)果一致。
此外，這些方法具有特異性，不會與其他正痘病毒（如痘苗病毒）發(fā)生交叉反應(yīng)。這些診斷方法的開發(fā)為MPXV快速檢測提供了新的、便捷的選項，將有助于控制和預(yù)防MPXV的流行。
圖2. RAA-LFS 檢測的靈敏度和特異性
圖3. 使用三種方法在臨床樣本中檢測MPXV，并與real-time PCR 進(jìn)行比較
利用real-time RPA和RAA-LFS進(jìn)行MPXV 檢測的結(jié)果與real-time PCR結(jié)果顯示出高度的一致性（100%），RPA-Cas12a則顯示出83.3%的一致性。在低濃度核酸擴(kuò)增過程中，將少量擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新管中時，可能會出現(xiàn)局部快速擴(kuò)增，造成進(jìn)樣誤差，導(dǎo)致檢測靈敏度降低。因此在未來的研究中，有必要將RPA-Cas12a方法進(jìn)一步優(yōu)化為單管檢測，以提高靈敏度。
基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的等溫擴(kuò)增測定技術(shù)（Isothermal Amplification Assays based on Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）此前已用于MPXV檢測開發(fā)。盡管該檢測也不需要特定的實驗室設(shè)備，但與nested PCR 的結(jié)果相比，該檢測僅具有72%的一致性，且需要大約60分鐘才能生成結(jié)果。此外，LAMP MPXV 檢測需要六對引物，但三種基于重組酶的擴(kuò)增檢測只需要一對引物和一個探針，從而簡化了診斷設(shè)計。之前發(fā)表的針對 G2R 基因的 MPXV-RPA 檢測結(jié)果與我們的real-time RPA 結(jié)果一致，但需要專門的儀器和訓(xùn)練有素的實驗室工作人員，這限制了其在非專業(yè)人士家庭使用的實用性。
相比之下，RAA-LFS 更加用戶友好，因為其操作簡單，并且與其他基于試紙的檢測（例如 pH 或妊娠測試）相似，這使得在家自我檢測更加可行。
總的來說，這項研究成功地將RPA/RAA技術(shù)與CRISPR-Cas系統(tǒng)相結(jié)合，開創(chuàng)了一個快速、準(zhǔn)確、方便的猴痘病毒檢測平臺。這不僅為當(dāng)前的疫情檢測提供了強(qiáng)有力的支持，更為未來的防控工作打下了堅實的基石。
原文鏈接：https://www.mdpi.com/1999-4915/14/10/2112
參考文獻(xiàn)：Mao L, Ying J, Selekon B, Gonofio E, Wang X, Nakoune E, Wong G, Berthet N. Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus. Viruses. 2022 Sep 23;14(10):2112. doi: 10.3390/v14102112. PMID: 36298667; PMCID: PMC9611073.
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