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測(cè)定意義：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL對(duì)于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的D-半乳糖通過(guò)糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來(lái)源，后期則主要參與細(xì)胞壁儲(chǔ)藏多糖水解。

測(cè)定原理：

α-GAL分解對(duì)-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GAL活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5ml蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在EP管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min

充分混勻，400nm處測(cè)定吸光值A，計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-GAL活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y =0.00543x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL活力(nmol/min /g鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GAL活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.123×(ΔA +0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。