類黃酮糖基轉移酶（UFGT）檢測試劑盒（HPLC法50T/48S）
| 貨號 | SH0070 | 售價（元） | 4368 |
| 規(guī)格 | 50T/48S | CAS號 |
- 產品簡介
- 相關產品
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0070 |
類黃酮糖基轉移酶（UFGT）檢測試劑盒（HPLC法50T/48S） |
50T/48S |
測定意義：
類黃酮是植物次生代謝產物，糖基化是類黃酮基本結構形成的最主要的修飾反應之一，提高了類黃酮苷元的化學穩(wěn)定性，這一過程主要由類黃酮糖基轉移酶催化的，使類黃酮-OH與UDPG反應，是黃酮合成途徑中的關鍵酶。
測定原理：
類黃酮糖基轉移酶催化花青素與尿苷二磷酸葡萄糖反應產生花青苷，主要以矢車菊素3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用HPLC檢測產物可反映類黃酮糖基轉移酶的酶活性。
組成：
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產品名稱 |
SH0070-50T/48S |
Storage |
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提取液：液體 |
50ml |
4℃ |
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試劑一：粉劑 |
1瓶 |
4℃避光 |
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試劑二：液體 |
5ml |
4℃ |
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試劑三：液體 |
8ml |
4℃ |
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標準品 |
1支 |
-20℃ |
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說明書 |
一份 |
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試劑一：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加全部試劑三溶解。
自備儀器和用品：
天平、研砵、離心機、恒溫水浴鍋、100目篩、高校液相色譜、針頭過濾器（水系、0.22μm）、濾膜（水系、0.45μm）、耐水C18柱（4.6×250mm）、樣品瓶、甲酸、甲醇（色譜級）、超純水
酶液提取:
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為1：2~5的比例（建議稱取約0.5g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
實驗前的準備工作：
1、檢測產物制備
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對照管 |
測定管 |
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樣本（μl） |
100 |
100 |
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試劑二（μl） |
100 |
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試劑一（μl） |
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150 |
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充分混勻，30℃反應30min |
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試劑一（μl） |
150 |
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試劑二（μl） |
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100 |
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充分混勻，10000g，4℃，離心10min，取上清過0.45μm水系濾頭，待檢測。 |
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2、將500 ml超純水和500 ml甲醇用0.45 μm的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水用水系濾膜抽濾，甲醇用有機系濾膜抽濾）。
3、流動相的配制：流動相A為1.6%甲酸水溶液； 流動相B為1.6%甲酸甲醇溶液。
4、將配好的流動相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。
5、標準品的配制：
在標準品中加入1ml甲醇，配成5μmol /ml 母液，將母液用甲醇分別稀釋成2μmol/ml ，1μmol/ml 、0.5μmol/ml 、0.25μmol/ml、0.125μmol/ml的標準品溶液。針頭式過濾器過濾后待測。
測定操作表：
1. 開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量10 μl，梯度洗脫為0~5min，85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80%A+20%B; 30~30.1min， 60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B。流速1ml/min，柱溫30℃，走樣時間為50min，檢測波長530nm，設置完畢保存方法組。
2.初始設置流動相A=85%，流動相B=15%，流速1 ml/min，待基線穩(wěn)定后開始加樣。
3.加入標準品10 μl，在50min內可分離C3G，C3G的保留時間在25min左右，（柱子不同，保留時間有差異），計算不同濃度的C3G標準品的峰面積。
4. 加入樣品10 μl，在相應保留時間處檢測C3G的峰面積。
酶活計算：
1. 以標準品濃度（μmol/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標計算C3G標準曲線。將樣品峰面積代入標準曲線，計算樣品C3G含量。
2. 酶活單位定義：
A． 每毫克組織蛋白每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。
UFGT活性（μmol/min/mg prot）= C×V反總÷（V樣×Cpr）÷ T=0.117×C÷Cpr
B． 每克組織每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。
UFGT活性（μmol/min/g 鮮重）= C×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷ T=0.117×C÷W
C：C3G濃度，μmol/ml ；V反總：反應總體積，0.35ml；V樣：加入樣本量，0.1ml，V樣總：加入提取液體積，1ml，Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質量，g，T：反應時間，min
注意事項：
1、流速由小到大調節(jié)，避免柱壓過大。
2、使用完畢時，先用50%的甲醇水溶液洗色譜柱45min，再用純甲醇沖洗色譜柱30min。
3、標準品的稀釋倍數要根據樣品中C3G濃度確定，樣品中C3G的峰面積必須落在不同濃度的C3G標準品的峰面積之內，該標準品稀釋倍數只是一個參考。