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MagCapture? 外泌體提取試劑盒 MagCapture? Exosome Isolation Kit PS
| 貨號 | 293-77601 | 售價（元） | 詢價 |
| 規(guī)格 | 10T | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關產(chǎn)品
產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
包裝 |
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293-77601 |
MagCapture? Exosome Isolation Kit PS |
10次 |
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299-77603 |
2次 |
MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS 采用磷酯酰絲氨酸（PS）親和 Tim４蛋白固化磁珠（PS親和法）的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高純度的外泌體，請使用 10,000×g 離心后的上清。該試劑盒使用含有 EDTA 的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來，所提取的完整外泌體和其他 EVs 可用于不同實驗，包括電鏡分析（TEM）、納米粒子追蹤（NTA）分析、投喂實驗、分子組成（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等）分析等。
◆膜表面磷酯酰絲氨酸（PS）親和法
Tim４蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有 EDTA 的洗脫液進行洗脫，捕獲高純度的完整細胞外囊泡。
◆優(yōu)點?特色
使用新型親和提取方法
無需進行超濾
● 使用磁珠改進了操作
● 流程優(yōu)化
※ 高重復性
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與其他提取方法相比 |
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方法 |
外囊泡純度 |
囊泡狀態(tài) |
可操作性 |
回收量 |
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PS親和法 |
■■■ |
完整 |
簡便穩(wěn)定 |
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超速離心法 |
■■ |
完整 |
簡便 |
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聚合物沉淀法 |
■ |
完整 |
簡便快捷 |
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密度梯度離心法 |
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完整 |
復雜 |
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抗體親和法 |
■■■ |
不完整 |
簡便穩(wěn)定 |
■■ |
樣品類型：細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、尿液等。
● 可以純化高純度和完整的細胞外囊泡
● 可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡
● 重復性高，回收量穩(wěn)定
● 簡易操作（約3.5小時）
● 啟用多個樣品（無需超速離心）
◆試劑盒組成
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產(chǎn)品名稱 |
包裝規(guī)格 |
保存條件 |
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MagCapture? |
10次 （產(chǎn)品編號：293-77601） |
2次 （產(chǎn)品編號：299-77603） |
2-10°C |
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試劑盒成分 (1) 鏈霉親和素磁珠 (2)生物素標記的外泌體捕獲 (3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液 (4)外泌體結(jié)合增強劑（×500） (5)洗滌緩沖液 (6)外泌體洗脫緩沖液 (7)反應管 |
<10 次> 600 μL×1 管 100 μL×1 管 35 mL×1 瓶 500 μL×1 管 75 mL×2 瓶 5 mL×1 瓶 22 管 |
<2 次> 120 μL×1 管 20 μL×1 管 7 mL×1 瓶 100 μL×1 管 30 mL×2 瓶 1 mL×1 瓶 1 管 |
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*每套試劑盒能完成５次回收實驗，即實際使用量為 10×5次/Kit 與 2×5次/Kit
◆案例?應用
從血清、血漿、尿液中提取的細胞外囊泡的分析
從人血清中提取外泌體的產(chǎn)量比較
使用該試劑盒，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用 CD9 和 CD63 抗體進行免疫印跡實驗。
● 檢測抗體
抗 CD9 兔多抗，System Bioscience公司
抗 CD63 兔多抗，System Bioscience公司
● 免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)
各樣品結(jié)果相當于 150 μL 的血清樣本。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。
從人EDTA血漿中提取外泌體
分別從１mL 的 EDTA 血漿、EDTA 血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進行 WB 檢測（抗 Flotillin2 抗體）。
● 檢測抗體
抗 Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 公司
● 使用樣品量
各１mL
● 免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)
各樣品結(jié)果分別對應 150 μL 樣品量。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。
從人尿液中提取外泌體的回收量比較
１mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗 CD9 抗體）。
● 檢測抗體
抗 CD9 兔多抗，System Biosciences 公司
● 使用樣品量
各１mL
● 免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)
各樣品結(jié)果分別對應 150 μL 尿液樣品。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，加入５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。
◆與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實驗
分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘毎囵B(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。
MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS【PS 親和法】
按照試劑盒的操作說明（反應時間：3小時），從1 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的 K562 細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。
超速離心法
將 10 mL 經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）進行超離（110,000×g，70 min），用 TBS 緩沖液重懸沉淀物后，再進行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
從 1 mL 經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。
※1：110,000×g 離心２小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果
分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用 NanoSight LM10 檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用最終濃度為２%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（２~4×1010 particles），在透射電子顯微鏡進行分析。
電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學 醫(yī)學系 華山教授、大阪大學 iFReC 中井先生
MagCapture? 可提取到很多 100 nm 左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。
K562 細胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）
用 PS 親和法、超離法和聚合物沉淀法從 K562 細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和 WB 法（CD63, Flotilin-2 和 Lamp-1 抗體）進行實驗。
回收量，不是回收率
● 檢測抗體
抗 CD63 小鼠單抗（MEM-259）
抗 Flotillin-2 小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司
抗 Lamp-1 小鼠單抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience 公司
K562 細胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10% FBS-添加培養(yǎng)基）
用 MagCapture? 外泌體提取試劑盒 、超離法和聚合物沉淀法，從 K562 細胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS 補充培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳，用銀染法和 WB 法（CD63、Lamp-1 和 Flotilin-2 抗體）進行實驗。同時，對外泌體提取片段進行質(zhì)譜測定，比較所有測定的多肽中來自 K562 細胞的人來源多肽的比例（由于添加到細胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）。
● 檢測抗體
抗 CD63 小鼠單抗（MEM-259）
抗 Flotillin-2 小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司
抗 Lamp-1 小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience 公司
健康人血清來源的外泌體中提取 miRNA 和 mRNA 的回收量比較
實驗數(shù)據(jù)
①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的 microRNA 和 mRNA 的回收量
通過超離法和 PS 親和法將 EVs 從正常人血清中分離，然后使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取 RNA。通過 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比較 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。
相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產(chǎn)量。
②運用不同的 RNA 提取方法提取 microRNA 和 mRNA 的回收量比較
運用 PS 親和法將 EVs 從正常人血清中分離，然后使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或基于 AGPC 法的試劑提取 RNA。通過 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比較 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。
◆外泌體蛋白質(zhì)組學分析
<實驗內(nèi)容及結(jié)果>
分別利用 PS 親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含 10% FBS（不含外泌體）的 K562 細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。將提取樣品用 10% 聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質(zhì)條帶。然后在凝膠內(nèi)進行消化，用 LC-MS 對蛋白質(zhì)進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質(zhì)組合的相關性比較。
比較通過 MASS 分析鑒定的前 10 個蛋白質(zhì)
白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質(zhì)
灰色柱：來自 FBS 的牛蛋白污染物
紅 色：來自外囊泡的標記蛋白
樣品：K562 細胞培養(yǎng)基（含有10%去除外泌體胎牛血清）
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PS 親和法 |
超離法 |
聚合物沉淀法 |
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1 |
71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein) |
DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) |
補體C3 (Complement C3) |
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2 |
膜聯(lián)蛋白A6 (Annexin A6) |
鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) |
α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin) |
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3 |
鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) |
血清白蛋白 (Serum albumin) |
纖連蛋白 (Fibronectin) |
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4 |
V-ATP酶A亞基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A) |
ATP依賴RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A) |
血清白蛋白 (Serum albumin) |
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5 |
浮艦蛋白-2 (Flotillin-2) |
微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain) |
血小板反應蛋白-1 (Thrombospondin-1) |
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6 |
程序性細胞死亡６互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein) |
71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71 kDa protein) |
補體C4 (Complement C4) |
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7 |
細胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain ) |
脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase) |
α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase) |
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8 |
膜聯(lián)蛋白A1 (Annexin A1) |
細胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain) |
載脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100) |
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9 |
220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa) |
U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase) |
胎兒血紅蛋白亞單位 (Hemoglobin fetal subunit beta) |
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10 |
膜聯(lián)蛋白A2 (Annexin A2) |
β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain) |
β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain) |
成對組合相關性比較
◆應用數(shù)據(jù)
Protein Assay BCA Kit 檢測外泌體的蛋白質(zhì)濃度
Protein Assay BCA Kit 是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測法中最通用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì) Cu2+ 離子被還原為 Cu+。Cu+與 BCA 形成絡合物，即產(chǎn)生紫色螯合物，蛋白質(zhì)濃度與紫色螯合物顏色深淺有關，通過測定 562 nm 處的吸光度，并與標準曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。
利用 MagCapture? 外泌體提取試劑盒從細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，通過 Protein Assay BCA Kit 高靈敏的檢測外泌體中蛋白質(zhì)濃度。
【實驗內(nèi)容及結(jié)果】
將通過 MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取的 25 μL 外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit 中試劑Ａ和試劑Ｂ混合液 200 μL。之后 60℃ 孵育 30 分鐘，檢測 560 nm 吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過 Protein Assay BCA Kit 的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質(zhì)濃度。
圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度的檢測
<BCA Assay 操作概要>
由于外泌體蛋白質(zhì)濃度相當?shù)?，因?span> BCA 測定時不要稀釋樣品。
① 將 BSA 標準溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白對照，分別每孔 25 μL 加到 96 孔板中。
② 分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔 25 μL 加入 96 孔板。
③ 把 200μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號：297-73101）的試劑Ａ盒試劑Ｂ混合液（Ａ：Ｂ=50：1）加入放有樣品的孔板中。
④ 60℃ 孵育 30 分鐘
⑤ 室溫條件下降低孔板溫度
⑥ 測定 560 nm 的吸光度
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
包裝 |
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297-73101 |
Protein Assay BCA Kit 蛋白測定試劑盒（二喹啉甲酸） |
250次用 |
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015-25613 |
2 mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液 |
1 mL×10 |
◆外泌體的標記和Hela細胞導入實驗
【實驗概要】
用 PKH67（Sigma公司）標記 MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡， Hela 細胞導入確認。
<外泌體PKH67標記>
1. MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實驗當天從 K562 細胞培養(yǎng)上清液提取外泌體）。
2. 用 BCA Assay 和 NanoSight 檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度。
3. 將相當于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
*請配制合適的使用量。
4. 將 2.0 μL 的 PKH linker 溶解在 0.25 mL 的 DiluentC 中?！?span>4×Dye solution*
*請配制合適的使用量。
5. 添加1/3樣品量的 4×Dye solution 至樣品中，混合后在室溫中孵育 5-10 分鐘。
6. 根據(jù)附帶的操作說明用 PBS 平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo 公司）。
7. 將 100 μL 樣品分別加入上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱*中，離心（最大添加量：100 μL）。
*準備必需的支數(shù)。
8. 將外泌體溶液*加入到已經(jīng)接種好 Hela 細胞的培養(yǎng)皿中，24 小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。
*根據(jù)實驗調(diào)節(jié)外泌體添加量
圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察
從 16 mL K562 培養(yǎng)上清液中超濾濃縮得到４mL 培養(yǎng)上清液作為樣品，通過 PS 親和法提取外泌體。
● 提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度：22.3 ng/μL
● 粒子濃度：1.2×108 particles/mL
將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的 Hela 細胞中，24小時后用熒光顯微鏡（左）和流式細胞儀（右）檢測捕獲情況。
Opti-MEM：取相同量用 PKH 標記后添加到細胞中作為陰性對照。
◆細胞培養(yǎng)上清?血清?血漿的預處理操作
樣品預處理：對樣品進行 1,200×g 離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進行 10,000×g 離心操作※2。
下文是細胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作，請參考血清/血漿的實驗步驟，做適當調(diào)整。
更換緩沖液（限制過濾）操作
用 50 mL TBS 緩沖液對１mL 已經(jīng)經(jīng)過離心處理的 EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。
1. 把 19 mL TBS 加進 VivaSpin20（100K）中。
2. 把 １mL 離心過的 EDTA 血漿上清添加在第１. 的VivaSpin20（100K）中，混勻。
3. 把第２. 的VivaSpin20（100K）在４℃下進行離心處理。
4. 減少上線的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 緩沖液。
5. ４℃下離心處理。
6. 減少上面的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 緩沖液。
7. ４℃下離心處理。
8. 減少上面的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 11 mL TBS 緩沖液。
9. ４℃下離心處理直至樣品液量達到１mL 以下。
10. 進行提取。
◆MagCapture? 外泌體提取試劑盒 操作步驟
◆產(chǎn)品列表
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
包裝 |
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293-77601 |
MagCapture? Exosome Isolation Kit PS |
10次 |
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299-77603 |
2次 |
◆相關產(chǎn)品
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
包裝 |
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016-27061 |
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) |
20 μL |
|
012-27063 |
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) |
100 μL |
|
CAC-SHI-EXO-M02-50UL |
Anti CD63 for Exosome Isolation |
50 μL |
|
CAC-SHI-EXO-M01-100UL |
Anti CD9 for Exosome Isolation |
100 μL |
|
CAC-SHI-EXO-M02-100UL |
Anti CD63 for Exosome Isolation |
100 μL |
|
Anti CD81 for Exosome Isolation |
100 μL |
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CSR-SHI-EXO-K010 |
ExoTrap? Exosome Isolation Spin Column Kit, for Protein Research 外泌體分離親和柱套裝，蛋白研究用 |
1 kit |
|
290-35591 |
Magnet Stand |
1個 |
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產(chǎn)品編號 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
產(chǎn)品等級 |
|
293-77601 |
MagCapture? Exosome Isolation Kit PS |
10次用 |
－ |
|
299-77603 |
MagCapture? Exosome Isolation Kit PS |
2次用 |
for Genetic Research |
|
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) |
20 μL |
- |
|
|
012-27063 |
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) |
100 μL |
- |
|
CAC-SHI-EXO-M02-50UL |
Anti CD63 for Exosome Isolation |
50 μL |
- |
|
CAC-SHI-EXO-M01-100UL |
Anti CD9 for Exosome Isolation |
100 μL |
- |
|
CAC-SHI-EXO-M02-100UL |
Anti CD63 for Exosome Isolation |
100 μL |
- |
|
CAC-SHI-EXO-M03-100UL |
Anti CD81 for Exosome Isolation |
100 μL |
- |
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CSR-SHI-EXO-K010 |
ExoTrap ? Exosome Isolation Spin Column Kit, for Protein Research |
kit |
- |
|
290-35591 |
Magnet Stand |
1個 |
- |